各位亲爱的患者朋友,我已经结束援藏工作,回到北京。
运动神经元病患者,是否可以注射疫苗?先说结论:可以。首先,运动神经元病是神经系统变性病,而非免疫介导的疾病。第二,运动神经元病患者往往存在呼吸肌肉的无力,呼吸道分泌物排出困难,所以,呼吸系统相对来说比较脆弱,需要尽可能的避免或减少呼吸道感染。对于运动神经元病患者的免疫接种,权威的UPTODATE的建议如下:当前的感染性疾病指南推荐,对于神经系统疾病可能影响呼吸道分泌物处理的患者,每年应接种季节性流感疫苗。此外,推荐所有慢性肺部疾病患者接种肺炎球菌疫苗。因此,ALS患者应该接种肺炎球菌疫苗和每年的季节性流感疫苗。对于新冠疫苗,虽然UPTODATE未能及时更新(目前的最新版本为2021年4月20日),但是基于以上的考虑,确诊的ALS患者接种疫苗是值得推荐的。
写在前面,文章为Christian原创,我对他表示由衷的感谢,感谢他不辞辛苦的整理,条理分明,内容详实可靠。Christian原创科普:干细胞移植技术治疗ALS的临床研究进展一ALS肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种进行性的退行性神经病变:大脑和脊髓中的运动神经元由于某种尚不十分清楚的(主要)有害因素遭到破坏并逐渐死亡,使之不能再支配肌肉进行自主运动,因此患者逐渐丧失运动能力,包括由肌肉驱动的语言、吞咽和呼吸能力。由于ALS是进行性的,也就是说病情是不断发展的,因此治疗ALS的效果有3种:彻底治愈、停止发展和减慢发展。1,想要彻底治愈ALS患者,需要2个条件:终止有害因素对运动神经元的毒害作用,同时,用新生的运动神经元替换掉已经死亡的运动神经元来支配肌肉运动。不幸的是,目前ALS的发病原因和致病机理尚不十分清楚——连有害因素都不知道,也就无法开发出相应的解毒办法;同时,运动神经元的体内再生目前也不可行……因此,目前理论上不可能有彻底治愈ALS的手段。事实上也是如此。2,也正是因为导致运动神经元死亡的主要有害因素尚不清楚,让ALS停止发展目前也尚不可行。3,减慢ALS病情的发展目前是可能的,利鲁唑和依达拉奉的作用即是如此。具体怎样做到?目前主要是“中和”掉ALS患者运动神经元所受到(次要)的毒害作用,以及对之主动提供营养和保护。那么,ALS患者的运动神经元表观上都出了哪些问题?这要分运动神经元本身出现的问题和运动神经元外周出现的问题2大类。前者包括:活性氧自由基胁迫(依达拉奉的作用就是清除这些自由基)、线粒体功能和RNA加工出错、蛋白错误聚集以及轴突运输和神经肌肉接点等处出现的问题。后者包括:活性谷氨酸积累产生的毒害作用(利鲁唑的作用就是抑制活性谷氨酸……另外,少吃味精!)和炎症反应等。药物和细胞制剂就通过解决这些问题来减慢ALS病情的发展。当然,减慢病情发展也有程度上的差异,我们后面会讲到。二干细胞本文题目里的第二个关键词,就是干细胞。这里,“干”字读4声,树干的干;不读1声,不是干燥的细胞。干细胞是未分化的,但能够自我更新、高度扩增和具有分化潜力的一类细胞。干细胞就像树干,能够分化发育成枝、叶、花和果实等不同植物器官。1,干细胞根据分化潜能可以分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞4类。取自受精后5天内的受精卵的细胞为全能干细胞,可以分化为人体全部220多种细胞类型,甚至能发育成一个完整的生命个体。取自受精后5天到5个月的胚胎的细胞为亚全能干细胞,可以分化为人体全部的细胞类型,但不再能发育成一个完整的个体。多能干细胞能分化成多种细胞类型,而专能干细胞只能分化成一种细胞类型。2,干细胞根据发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。前者来源于胚胎,往往具有更强的增殖和分化能力;直接使用具有成瘤性,能形成畸胎瘤,诱导分化后则不会;使用时带有一定的伦理压力。后者顾名思义来源于成人身体,无成瘤性,使用时无伦理问题。3,干细胞根据供体来源可以分为自体干细胞和异体干细胞。前者来自自己,使用时不用担心免疫排斥的问题,但是可能依然带有相同的遗传缺陷。后者来自别人,使用时可能发生免疫排斥,但是可能纠正患者自身携带的遗传缺陷。4,骨髓干细胞、脂肪干细胞、脐带血干细胞和胎盘干细胞都是指干细胞的组织来源。脐带血干细胞和胎盘干细胞又被称为围产期干细胞,属于成体干细胞,主要成分是间充质干细胞,还包括造血干细胞等,增殖和分化潜能介于胚胎干细胞和其他成体干细胞之间。5,神经干细胞来源于中枢神经系统组织。神经干细胞来源于中枢神经系统组织。神经干细胞来源于中枢神经系统组织。重要的事说三遍。它可以来自胚胎、胎儿或成人,具有分化成所有种类神经细胞的潜能、包括神经胶质细胞和神经元等,具有多能分化、归巢(自行去它该去的地方)、神经营养、神经保护和免疫调节等特性。将由其他类型的干细胞(例如骨髓干细胞或脂肪干细胞)分化而来的神经祖细胞或前体细胞称为神经干细胞的行为都是耍流氓。6,诱导性多能干细胞是在体细胞中人工启动若干基因行使功能,使体细胞的分化发育重新编程而获得的具有类似胚胎干细胞分子特性、增殖能力和分化潜能的一类多能干细胞。目前诱导性多能干细胞尚未直接在ALS治疗中获得应用,因此在此不再赘述。但是如果有公司告诉你可以为你量身定制诱导性多能干细胞的话,那基本上是在忽悠你,因为这个过程目前将耗时半年以上、耗资百万元级,并且对技术操作和实验设施都有非常高的要求。最后,既然是讲研究进展,就具有一定的时效性。本文于2019年4月4日收笔。考虑到本文对该领域进行了系统的回顾和综述,加上临床试验耗时较长,本文在今后相当长的时间内将仍具有一定的参考价值。三干细胞移植治疗ALS的总体情况2007年至2018年间,全球共进行了86项针对治疗ALS的临床研究。这些研究或最终完成,或中途终止,但最终只有一个药物获得了FDA的批准,即2017年5月获准应用于ALS治疗的依达拉奉。目前,应用干细胞移植技术治疗ALS的临床研究方兴未艾,其研究主力是国外的生物技术公司、大专院校和医院。首先,我们看一下国外在这个领域的总体情况。1,以干细胞技术为主营业务的生物技术公司唱主角。这也是因为医院一般不具有干细胞培养和分化技术和设施。下面就将以这些生物技术公司为线索逐一介绍其临床研究进展。2,医院方面积极配合,尤其是那些大医院、好医院,更是充当探索干细胞移植技术治疗ALS的排头兵。例如,配合美国头脑风暴细胞疗法公司进行临床试验的医院就包括大名鼎鼎的哈佛大学附属麻省总医院和梅奥医学中心等,配合美国神经干细胞公司进行临床试验的医院也包括麻省总医院,及埃默里ALS中心和埃默里大学医院等。再例如,以色列在ALS研究方面处于全球领先地位的Hadassah医院就积极承担了两家生物技术公司的干细胞疗法临床试验。在应用干细胞治疗ALS的过程中,干细胞制剂的移植技术和给药途径,以及术后观察和疗效评估,都是至关重要的步骤。一般来说,生物技术公司自身无法完成这些步骤,必须仰仗正规医院,尤其是那些在ALS研究、诊断和护理方面有着丰富经验的专业医院。3,自2007年起,美国FDA要求细胞疗法同新药一样要进行登记和审批,因此严格规范了干细胞治疗ALS的开发和试验流程,极大程度上提高了临床试验的合理性和安全性。每个临床试验都必须有大量在动物模型上进行的临床前研究做支撑,同时,所有这些试验的申请和结果都对监管部门和公众公开。而且,用于治疗ALS的细胞疗法和制剂属于孤儿药,其开发过程受美国政府的鼓励和支持,其申请、审批和上市都享受特殊的优惠政策和绿色通道。反观我国,2015年国家出台了干细胞管理办法,只允许干细胞用于基础研究,禁止用于临床实践。因此,目前国内的干细胞治疗仍属于黑色地带,任何临床应用还都属于违法行为。特别是2016年的魏则西事件后……(此处删去一万字)。而且,国家对干细胞生产企业的规范也只是自律性的。但与此同时,应用干细胞进行临床治疗在我国目前实际上却处于一种泛滥的状态,大都缺乏临床前和临床试验的支撑和保障,干细胞制剂的生产企业也是鱼龙混杂、良莠不齐……(此处删去一万字)。无论是考察国外干细胞临床试验的情况,还是今后考察国内干细胞临床治疗的方案,应该着重关注以下几个要点:1,干细胞的来源。是骨髓、脂肪、胎盘、脐带血间充质干细胞?还是真正的神经干细胞?2,干细胞经诱导分化成的细胞的特性。(或者直接移植干细胞本身?)3,适合进行该干细胞疗法的ALS患者所应满足的条件。就像依达拉奉一样,只有年龄在20-75岁之间、发病不超过2年、肺功能在80%以上和病情指数在24分以上的可能或确定ALS患者才适合使用,任何一个治疗ALS的干细胞疗法都有一个患者范畴。例如,美国头脑风暴细胞疗法公司进行的3期临床试验就只针对病情快速发展的ALS患者。4,给药途径。是静脉滴注、肌肉注射、腰椎穿刺还是特定部位的介入治疗?5,疗效的生理检测。通常由专业医院实施,包括ALS病情指数、肺功能、肌力、肌肉形态等定量指标。不能只是术后简单询问患者的主观感受草草了事。修订的ALS功能评分量表(ALSFRS-R)是评估ALS患者病情的一个问卷,其分项得分的总和可相对定量地反映患者当时的病情。直观和简单起见,在本文中以“ALS病情指数”一词代替。它包含4大项、12小项;每小项功能完好得分为4、没有功能得分为0;而ALS病情指数就是这12小项得分的总和,最高48分,最低0分。A.延髓功能:语言,流涎,吞咽;B.呼吸功能:呼吸困难,端坐呼吸,呼吸支持;C.粗大运动:床上翻身和调整被褥,行走,上楼梯;D.精细运动:写字,餐具使用,穿衣和洗漱。统计结果显示,患者ALS病情指数平均每月下降1.1,平均每年下降13.32。6,疗效的分子检测。通常由生物技术公司实施。例如,如果该干细胞疗法可以营养运动神经元,那么需要给出各种神经营养因子增加的定量数据;如果该干细胞疗法具有免疫调节的功效,那么需要给出各种免疫分子标志物增加的定量数据。7,随访。临床试验阶段的随访可能长达9年之久,而且一直跟踪进行分子检测和生理检测。四美国头脑风暴细胞疗法公司(Brainstorm Cell Therapeutics;www. brainstorm-cell.com)——三期临床试验(进行中)的总述。简单讲,头脑风暴公司细胞制剂NurOwn的三期临床试验是从ALS患者自体的骨髓中分离出间充质干细胞并诱导其分化成分泌神经营养因子的间充质干细胞,然后将其通过腰椎穿刺注射进入患者的脑脊液中,利用其分泌的神经营养因子保护尚存活的运动神经元,从而减慢ALS病情的发展。——三期临床试验的应试患者条件。NurOwn的三期临床试验从2017年8月开始,计划于2020年7月结束,为随机分组、有安慰剂对照的双盲试验,计划招募200名ALS患者应试,应试患者需满足以下条件:年龄在18-60岁之间、发病不超过2年、肺功能在65%以上、病情指数不低于25分且有肢体肌力下降症状、病情快速发展的ALS患者。——三期临床试验的方案。应试的ALS候选患者首先经过体检、筛选和随机分组,然后取骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离(此时可以冷冻储存)、培养、扩增和诱导分泌神经营养因子,约1个月后开始第1次腰椎穿刺、回输可分泌神经营养因子的间充质干细胞进入脑脊液。总共进行3次移植,每次间隔8周,最后一次移植完成的12周后进行病情指数的疗效评估,同时进行分子检测的疗效评估,检测项目包括神经营养因子、炎症因子和细胞因子等。——安全性。NurOwn的一期和二期临床试验起始于2010年,在以色列和美国完成,三次试验(1/2、2a和2)分别招募了12、14和48名ALS患者应试。一期和二期临床试验的主要目的是考察该细胞制剂治疗ALS的安全性,同时兼顾其初步疗效。试验结果表明,该细胞制剂对应试患者的不良反应从轻度到中度,基本上可被耐受,总体上是安全的。在2a期临床试验中,细胞移植后的不良反应包括头痛(79%)、发热(57%)、腰痛/腿痛(57%)、呕吐(21%)和颈部僵硬(7%)等,但是这些不良反应是一过性的,最多持续3天。在高剂量组的4名ALS早期患者中,细胞移植后有1人死亡,另有1人自杀(安乐死);研究者称均与细胞治疗本身无关。——一期和二期临床试验的疗效。在以色列Hadassah医院进行的NurOwn的1/2期和2a期临床试验为单组、非盲试验。将术后6个月随访的结果和术前比对,腰椎穿刺给药的应试患者的ALS病情指数变化为-1.2到0.6分/月(ALS患者平均每月下降约1.1分),而肺功能下降减缓5.1%到1.2%/月(以中间值3.2%计算,每月可以延缓发展约1天)。在统计学上,按ALS病情指数和肺功能下降斜率放缓25%以上计算,所有应试者中有87%的患者对该细胞疗法做出了反应。在分子水平上,每个应试患者脑脊液中的神经营养因子含量都有显著的提升。——有效的细胞移植途径。由于血脑屏障的阻碍,临床前试验和其他课题组的研究结果表明,无论是间充质干细胞还是神经营养因子,通过静脉滴注给药对ALS治疗都基本无效,因此1/2期和2a期临床试验均未使用静脉滴注的细胞移植手段;然而将分泌神经营养因子的间充质干细胞直接移植到神经肌肉接点处的肌肉注射途径也被1/2期和2a期临床试验证实基本无效,而只有腰椎穿刺的移植途径才有明显疗效,因此从3期临床试验开始,细胞移植过程只采用腰椎穿刺的方法。——使用自体干细胞的缺点。细胞制剂NurOwn从发音上听,是“神经元”的意思;从拼写上看,是“只用自己的”的意思——显然,头脑风暴公司在标榜其来自患者自己的自体间充质干细胞,透露着一种个性化定制的高大上。自体干细胞的最大优势是不引发免疫排斥反应,但是这个优势被腰椎穿刺的给药途径所抵消,因为这种移植方式绕过了血脑屏障,使细胞制剂不与血液接触,在理论上使免疫排斥反应发生的几率归零。自体干细胞依然携带着可能相关的遗传缺陷,制备过程又要额外耗费时日,也势必极大程度地抬高治疗成本,不利于群体治疗。据悉,头脑风暴公司该细胞疗法一个疗程的费用将在30-35万美元。——作用机理。NurOwn减慢ALS病情发展的核心要素是发挥神经元保护作用的多种神经营养因子,而间充质干细胞是其载体,某种意义上更像递送这些神经营养因子的介质。当然,这些分泌神经营养因子的间充质干细胞同时也是一个生物反应器,在移植后的数个月内依然可以在中枢神经系统中存活并源源不断地制造出新的神经营养因子。在美国进行的NurOwn的2期临床试验结果发现,干细胞移植后患者脑脊液中的小RNA组成也发生了显著变化;这些小RNA通过负向调控其靶标基因的表达参与神经保护和免疫调节等生理过程。多种小RNA和多种神经营养因子一起保护运动神经元不受进一步的伤害,这种多靶点的作用机制使该干细胞制剂有可能优于单一作用机制的小分子药物。五以色列卡迪玛干细胞公司(Kadimastem;www.kadimastem.com)——一期和二期临床试验(进行中)的总述。简单讲,卡迪玛公司是将人类胚胎干细胞通过培养条件诱导分化成为星形胶质细胞,该细胞制剂被命名为AstroRX;然后将其通过腰椎穿刺的移植途径注射进入ALS患者的脑脊液中,利用其吸收过量的活性谷氨酸(类似利鲁唑的作用)、清除活性氧自由基(类似依达拉奉的作用)、降低有害物质含量和分泌多种神经营养因子(类似NurOwn的作用)等功能,保护和营养尚存活的运动神经元,从而减慢ALS病情的发展。——一期和二期临床试验的计划。AstroRX的1/2a期临床试验从2018年4月开始,2018年4月26日招募到了第一位应试的ALS患者,而试验计划总共招募21名应试患者。应试患者需满足以下条件:年龄在18-70岁之间、发病不超过2年、肺功能在70%以上、病情指数不低于30分、不能过胖或过瘦、可能或确定的早期ALS患者。第一组的5名应试患者于2019年2月24日完成了细胞移植,其试验结果有望在2019年8月底前公布。该临床试验为非盲试验,主要目的是考察细胞制剂AstroRX治疗ALS的安全性和疗效。试验分为4组,分别为低剂量、中剂量和高剂量的单次移植,和中剂量(带有间隔期)的两次移植。术后将观察不良反应,并将连续11个月调查疗效,检测项目包括ALS病情指数、肺功能、手掌握力、肢体肌力和生活质量问卷等。——星形胶质细胞制剂AstroRX的特点:1,由人类胚胎干细胞诱导分化而来。卡迪玛公司使用的2个临床级的人类胚胎干细胞系分别是来自英国纽卡斯尔大学的NCL14和来自以色列Hadassah医院的HADC100。2,移植的是经充分分化的成熟星形胶质细胞,而不是简单粗暴地回输只经过分离、增殖的干细胞产品,或部分分化的干细胞产品;治疗机理清晰,疗效更加稳定,可保证无成瘤性。3,非依个人定制的成品细胞制剂,随用随取、时间上不会延误使用;相比较自体干细胞产品成本更加低廉,使治疗更加经济,适合群体治疗。4,替换患者中枢神经系统内因ALS而受损进而功能紊乱的星形胶质细胞,恢复健康星形胶质细胞的多功能性,通过多种有益的作用机理营养和保护运动神经元。——什么是星形胶质细胞?既然AstroRX的性质是高度分化的星形胶质细胞,那么让我们来了解一下星形胶质细胞。人类的神经系统只含有2类细胞:神经元和神经胶质细胞。神经元包括感觉神经元和在ALS中受损伤并逐渐凋亡的运动神经元等。中枢神经系统的神经胶质细胞数量上是神经元的10倍,包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞4种。其中星形胶质细胞是体积最大、数量最多的一种神经胶质细胞,其功能包括:1,构成三维支架体系,支持和固定神经元胞体和纤维网络,就像电器包装箱里的泡沫垫。2,当神经元发生损伤、衰老而死亡时,可通过增生填补缺损,从而起到修复和再生的作用。3,从毛细血管向神经元输送营养物质,合成和分泌多种生物活性分子及神经营养因子,并参与组成和调控血脑屏障,因此可以营养和保护神经元。4,排出神经元的代谢产物,吸收神经元释放的谷氨酸和γ-氨基丁酸,消除氨基酸递质对神经元的持续作用,并可维持胞外正常的钾离子浓度,从而调控神经元的化学成分。5,星形胶质细胞之间、以及与神经元之间可以形成交流和交互应答,从而调节神经元的活性,影响神经信号的传导,通过相互作用和协调反应参与脑部的信息处理。——星形胶质细胞与ALS。星形胶质细胞以一种非细胞自主途径参与ALS的致病机理:1,无论星形胶质细胞是来自家族性ALS患者,或散发性ALS患者,或ALS患者的诱导性多能干细胞,还是ALS动物模型,都对运动神经元有毒害作用;ALS动物模型的体内实验也证实了这一点。这种情况可能是由于ALS星形胶质细胞分泌出某种有害物质,也可能是由于活性谷氨酸积累造成的,因为研究发现ALS星形胶质细胞的谷氨酸吸收功能也遭到了破坏。2,炎症介导的神经损伤被认为是促进ALS病情发展的一个重要因素。星形胶质细胞在参与细胞应激反应时可以释放多种炎症因子,而这些炎症因子可能诱导了运动神经元的凋亡。3,ALS患者的星形胶质细胞分泌的神经营养因子水平较低,可能因此加速了运动神经元的退化和病情的发展,而这种情况在ALS动物模型中可以被外源的神经营养因子部分逆转。当星形胶质细胞分泌神经营养因子的水平降低时,小鼠能够出现ALS的症状,也说明ALS患者的星形胶质细胞分泌神经营养因子的功能受损可能是导致运动神经元受损的一个因素。正是因为ALS患者的星形胶质细胞功能失调并开始攻击运动神经元,卡迪玛公司认为将其用外源健康的星形胶质细胞替换掉,将是治疗ALS的一种有效手段。这个假说是AstroRX及其相关试验的理论基础。——临床前试验。由于AstroRX的临床试验尚未结束,目前尚无试验结果可供讨论,因此在此着些笔墨介绍一下AstroRX的临床前试验。这些试验主要是在ALS动物模型上完成的。1,安全性。免疫缺陷型小鼠对细胞移植的临床不良反应和成瘤性更加敏感。将AstroRX通过小脑延髓池注射进入NSG免疫缺陷型小鼠中枢神经系统的脑脊液中,之后持续9个月的观察和检测发现,在临床上没有出现不良反应,脑部和脊髓中也未发生肿瘤或畸胎瘤,和对照相比注射AstroRX的小鼠的体重以及各项血项指标和血液生化指标均没有差异。2,持效性。AstroRX可在NSG小鼠的中枢神经系统中存活至少9个月,原位杂交显示其沿神经轴附着在软脑脊膜上。定量PCR未在其他9个器官中检测到AstroRX星形胶质细胞。3,体外实验。在体外,AstroRX可以吸收溶液中的谷氨酸,吸收速率与从人脊髓中提取出来的星形胶质细胞相同。浸泡在过氧化氢(双氧水)溶液中的小鼠脊髓运动神经元会因为氧化胁迫而凋亡,而当与AstroRX共同孵育(浸泡)时,运动神经元的凋亡显著降低,说明AstroRX有保护运动神经元免受氧化损伤的作用。将AstroRX与大鼠的神经元共培养可以加速神经元轴突的伸长,说明AstroRX有促进神经元生长的活性。在培养AstroRX的上清液和细胞裂解液中均检测出了神经营养因子;分泌组学研究进一步发现AstroRX可以分泌约40种对运动神经元有益的神经营养因子,及可促进ALS治疗的金属蛋白酶抑制剂。4,体内实验。将AstroRX移植到ALS小鼠和大鼠模型的脑脊液中可以显著推迟ALS的发病时间、延长患病动物的寿命并改善其运动机能。总之,临床前试验证明AstroRX具有人健康星形胶质细胞的功能特性,有望补偿在ALS中受损的星形胶质细胞发挥多重功效来营养和保护运动神经元,延缓ALS病情发展,延长患者的存活时间并提高患者的运动机能和生活质量。目前AstroRX已在美国FDA获得孤儿药资格。六美国神经干细胞公司(Neuralstem;www.neuralstem.com)——一期和二期临床试验(已完成)的总述。简单讲,神经干细胞公司的神经干细胞制剂NSI-566(以下简称“566”)是来自一个妊娠八周后人工流产的男性胎儿颈胸段脊髓的人类脊髓干细胞系,经过平板单层附着培养和增殖,在将ALS患者的颈椎/腰椎摘除后通过微量注射进入脊髓前角。临床试验证明细胞制剂566及移植手术技术安全,但不能改变应试患者ALS病情的发展。——一期临床试验的计划。566的一期临床试验从2009年1月开始,共招募了15名应试ALS患者。应试患者满足以下条件:年龄在18岁以上、肺功能在60%以上、下肢肌力下降、可以下肢瘫痪甚至已经气切、需有看护人陪同、住所距离试验医院较近、可能或确定的ALS患者。一期临床试验为非盲试验,主要目的是考察细胞制剂566(细胞活力>70%)及移植技术的安全性,并采用风险逐渐升级的试验方案。术后观察不良反应,并连续48个月调查疗效,检测项目包括ALS病情指数、肢体肌力、手掌握力、肺功能、电阻抗肌动图、疼痛情况、脑部和脊椎磁共振、尿常规、生活质量问卷、痉挛情况和移植细胞的存活时间等。——二期临床试验的计划。566的二期临床试验从2013年5月开始,共招募了15名应试ALS患者。应试患者满足以下条件:年龄在18岁以上、发病不超过2年、肺功能在60%以上、有肢体肌力下降/痉挛症状但颈部肌力正常、需有看护人陪同、下肢未瘫痪的早期ALS患者。二期临床试验为非盲试验,主要目的是考察移植细胞制剂566治疗ALS的可行性、安全性、毒性和最大(安全)耐受剂量;566的细胞浓度和细胞数量都有显著增加,移植手术在3家医院开展。二期临床试验全部为颈椎/+腰椎细胞移植,以期改善应试患者的呼吸功能,因为控制呼吸肌的运动神经元处于颈椎部位。术后连续24个月调查疗效,检测项目基本同上。——一期和二期临床试验的特点:1,FDA批准进行的第一例细胞制剂应用于ALS治疗的临床试验。2,细胞制剂为未分化的(真正的)神经干细胞:人类脊髓干细胞。3,应试ALS患者需进行颈椎和/或腰椎摘除手术以暴露脊髓,然后使用自制(非标准化)的金属型架固定装置支持自制(非标准化)的微量注射装置向脊髓的特定部位移植神经干细胞,手术过程对医生的外科技术有很高要求,手术时间长达3至6.5小时。而且颈椎和腰椎移植的固定支撑装置不同,不同医生的手术效果也不相同……可以想象,这种设备特殊、操作复杂的干细胞移植技术今后很难广泛应用,而且对ALS患者也会造成更多的痛苦和不便:多名患者需接受腰椎和颈椎摘除2次手术,术后大多不良反应也都来自手术本身。如果进行设立安慰剂组的双盲随机分组临床试验的话,安慰剂对照组的应试患者即便只注射盐水也需要接受颈椎/腰椎摘除手术,这在医学伦理上讲是极其不人道的。4,为防止发生免疫排斥反应,应试ALS患者需要在术前和术后使用4种免疫抑制剂:巴利昔单抗、强的松、他克莫司和霉酚酸酯;且后两种将终生服用。长期服用免疫抑制剂带给应试患者诸多不良反应,甚至引发真菌感染和皮肤癌等。——安全性。在一期临床试验中,12名患者接受了腰椎细胞移植,其中1例术后暂时性脑病变,2例肺栓塞,2例支气管炎/肺炎,1例呼吸困难,1例房颤,1例基底细胞癌,1例尿潴留,1例脑脊液渗漏和1例伤口开裂需要重新手术,其他不良反应包括疼痛和恶心等;15名患者接受了颈椎/+腰椎细胞移植,其中1例术后尿潴留,1例脊柱变形,1例伤口开裂和感染需要重新手术,其他不良反应包括疼痛、恶心、咽喉水肿和腘动脉血栓等。研究者认为细胞制剂566及移植技术是安全的、没有长期副作用,而不良反应可被应试ALS患者耐受。在二期临床试验中,15名患者共接受了18次颈椎/腰椎细胞移植手术。由于手术操作、手术装置、细胞制剂566及免疫抑制剂等因素,应试患者在术后共发生139次不良反应及4次严重的不良反应,包括1例因脊髓肿胀导致的疼痛、感觉障碍和下肢轻瘫,及1例中枢性疼痛综合症;值得注意的是,这2名患者均接受了最高剂量的细胞移植。研究者认为细胞制剂566、试验剂量及移植技术基本上是安全的。——持效性。对6名去世的应试ALS患者进行尸检、定量PCR和细胞分型标志物检测发现,术后半年至2.5年后,在全部6名患者体内仍能检测出566来源的活细胞:部分细胞保留了神经干细胞的性质,而另一部分则发育成了神经元,但没有分化成星形胶质细胞或少突胶质细胞。由于566来自一个男性胎儿,因此在女性患者体内还可以通过对细胞的性染色体进行荧光原位杂交来辨别细胞来源。该研究还发现持续的免疫抑制对移植细胞的存活并无作用。——一期和二期临床试验的疗效。两期临床试验结果显示,手术移植神经干细胞制剂566后,应试患者的ALS病情发展没有变化;也就是说,不会减慢病情发展,也不会加速病情发展。——其他:1,566治疗ALS的二期临床试验已于2016年11月结束,但是神经干细胞公司至今还没有向FDA申请进行三期临床试验。2,在ALS大鼠模型上进行的566临床前试验结果显示,在出生后63天时向大鼠颈椎和腰椎移植566,和对照相比可延缓起病10天,且发病后可延长存活时间7天(共158天比141天)。3,566还在治疗慢性脊髓损伤和缺血性脑卒中上进行了临床试验。在治疗缺血性脑卒中上进行的临床试验由干细胞公司的苏州分公司负责实施,在陆军总医院(原北京军区总医院)附属八一脑科医院完成。试验于2012年开始,于2018年结束,共招募了18名应试患者。七韩国核心干细胞公司(Corestem;www.corestem.com)——一期和二期临床试验(已完成)的总述。简单讲,核心干细胞公司的细胞制剂NEURONATA-R(以下简称“NN”)的一期和二期临床试验是从ALS患者自体的骨髓中提取、分离出间充质干细胞并培养、增殖,但不经进一步诱导分化,然后将其重复两次通过腰椎穿刺的移植手段注射进入患者的脑脊液中。试验结果表明细胞制剂和移植方法对患者安全。术后4-6个月内,应试患者的ALS病情指数下降明显放缓,但是肺功能的下降没有变化。长期监测(>6年)发现细胞移植患者的存活时间和对照相比也没有显著变化。——一期和二期临床试验的计划。NN的一期临床试验从2011年1月开始,于2011年11月结束,共招募了8名应试ALS患者。应试患者满足以下条件:年龄在25-75岁之间、发病不超过5年、上/下运动神经元都受损伤、肺功能在40%以上(如果使用无创呼吸机则不超过12小时/天)、ALS病情指数在31-46之间、长期服用利鲁唑、可能或确定的ALS患者。一期临床试验为单组、非盲试验,主要目的是考察细胞制剂NN治疗ALS的安全性和疗效,采用两次采集患者骨髓和两次腰椎穿刺移植的试验方案。术后连续12个月调查不良反应和疗效,检测项目包括常规体检(血项、血常规、尿常规、肝功能、肾功能、心电图和X光胸片等)、ALS病情指数和肺功能等。NN的二期临床试验从2011年11月开始,于2013年8月结束,共招募了64名应试ALS患者,应试患者条件、细胞制备和移植、不良反应及疗效调查等基本同一期。二期临床试验为随机分组、带有平行对照组的单盲试验;出于医学伦理考虑,对照组患者未做腰椎穿刺/脑脊液采集。另外,对应试患者的C9orf72、SOD1、FUS、TARDBP、ANG和OPTN等基因进行了测序和遗传学排查,并对应试患者的长期存活率进行了长达6年多的跟踪、调查和分析。——安全性。共有7名应试患者完成了一期临床试验,术后共发生一级和二级不良反应36例,以骨骼肌和关节疼痛为主;其中26例与细胞制剂无关,10例与细胞制剂相关,包括头痛、发热和疼痛等。共有64名应试患者完成了二期临床试验的安全性评估。术后6个月内,不良反应的总数在移植组和对照组之间没有显著差异,而移植组的不良反应主要包括流感症状、腰痛和肌肉痛等,移植组患者与细胞制剂相关的不良反应主要包括头痛、发热和疼痛等;移植组共发生3例严重不良反应,少于对照组的6例;移植组共有1名应试患者死亡,少于对照组的3名。研究者认为该试验方案可行、安全,相关不良反应属轻度和暂时性的、可被患者耐受。——疗效。共有7名应试患者完成了一期临床试验。在细胞移植后的6个月中,7名患者中有5人的ALS病情指数保持稳定、没有下降,另外2人的ALS病情指数甚至略有上升,说明ALS病情停止发展,甚至被稍微逆转;但是7名患者肺功能的下降速度都没有变化。2名患者脑脊液中的多种细胞因子经检测含量发生了变化。注意:NN一期临床试验应试患者的样本数量较小,未设立对照组,且术后未做长期跟踪监测。共有56名应试患者(对照组25名,移植组31名)完成了二期临床试验。在完成细胞移植6个月后,对照组的ALS病情指数下降6.48,而移植组下降3.10,说明移植NN使应试患者ALS的病情发展在6个月中明显减慢。但是完成细胞移植4个月后,应试患者肺功能的下降速度在两组之间没有显著差异:对照组下降10.75%,移植组下降11.28%。移植组患者脑脊液中的多种细胞因子经检测含量发生了变化,而全部应试患者家族性ALS遗传基因的筛查结果均为阴性。ALS患者的存活时间在对照组和移植组之间没有显著差异:对照组48±6个月,移植组55±4个月,说明移植NN并没有延长ALS患者的存活时间。研究者认为造成这种结果的原因可能是自体骨髓来源的间充质干细胞能在脑脊液中存活时间的较短,单疗程的细胞移植可能持效性不佳,并建议ALS患者每6个月进行一次细胞移植。然而,54岁以下ALS患者的存活时间,对照组为48±9个月,移植组为65±5个月,p=0.101,有一定差异;而54岁以下ALS患者未气切的存活时间,对照组为25±3个月,移植组为48±6个月,p=0.103,也有一定差异,说明移植NN对延长54岁以下年轻ALS患者的存活时间可能会有一定效果。——一期和二期临床试验的总结及其他:1,ALS患者自体来源的骨髓间充质干细胞经分离和增殖后,未经进一步诱导和分化,直接回输到患者自身的脑脊液中。2,两次重复采集患者的骨髓,间隔26天;两次重复腰椎穿刺细胞移植,间隔26天。干细胞体外培养28天后,细胞活力>80%,再用患者的脑脊液重悬后,回输到患者的脑脊液中。3,较早使用了腰椎穿刺的细胞移植途径:A,相比较直接定位手术植入的细胞移植手段,具有更小的入侵性,可以给ALS患者带来更小的痛苦,并避免加速病情发展;B,可以利用脑脊液的流动性将干细胞制剂向整个中枢神经系统扩散,充分覆盖ALS退行性病变的整个神经轴区域;C,不像静脉滴注的细胞移植手段那样会将干细胞滞留在肺部等器官。4,NEURONATA-R于2014年7月被韩国食品与药品安全部获准上市,并于2015年2月投放市场;核心干细胞公司称NEURONATA-R是全球第一款治疗ALS的干细胞产品。5,在NN的一期和二期临床试验开展以前,除了在ALS动物模型上进行的临床前试验外,还完成了两次先导性临床试验。然而,二期临床试验早已于2013年8月结束,核心干细胞公司至今仍未向FDA申请开展三期临床试验。但是,核心干细胞公司已经开展了异体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS的一期临床试验。据称,异体骨髓间充质干细胞移植可节约治疗的准备时间和细胞制剂的成本,并可避免老年患者自体干细胞退化等问题。八非生物技术公司驱动的干细胞移植治疗ALS的临床研究I.意大利诺瓦拉ALS中心和都灵玛格丽塔儿童医院:自体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS10名应试ALS患者(20-65岁、四肢起病、发病不超过3年、满足ALS病情指数要求、肺功能在50%以上、轻度到中度瘫痪、可能或确定的散发性ALS患者)参加了自体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS的一期临床试验。从ALS患者自体的骨髓中提取、分离出间充质干细胞并培养、增殖,但不经进一步诱导分化,然后将其通过外科显微注射的途径移植进入患者胸椎的前角。试验结果表明细胞制剂和移植方法对患者安全。由于这些应试患者都曾在该试验医院就诊,因此可以提供术前9个月的病情发展数据,为统计术后疗效提供了极大便利。术后连续24个月的监测结果显示,应试患者的ALS病情指数和肺功能的下降速度都没有发生任何变化。研究者认为,疗效不佳可能是因为选择了对ALS致病并不十分重要的胸椎进行细胞移植。尽管术后死亡的患者在生前都签署了意愿书,但是患者家属仍然拒绝尸检,因此无法检测自体骨髓间充质干细胞在患者脊髓内的存活情况。II.意大利诺瓦拉ALS中心和都灵玛格丽塔儿童医院:自体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS试验方案基本同上的另一项一期临床试验,旨在验证细胞移植的长期安全性和疗效。19名应试ALS患者中,9名于2001年11月接受了细胞移植,另外10名于2003年9月接受了细胞移植;术后每隔3个月检测患者的不良反应和疗效,连续进行9年,直至患者死亡。调查结果表明,细胞制剂和移植方法对应试患者非常安全,但是不能减慢ALS病情的发展。III.意大利诺瓦拉ALS中心和特尔尼圣玛丽医院:神经干细胞移植治疗ALS6名应试ALS患者(20-75岁、下肢瘫痪、术前6个月内病情持续发展、血氧在90%以上且无睡眠呼吸暂停或不足、肺功能在60%以上、如果使用无创呼吸机则不超过6小时/天、可能或确定的散发性ALS患者)参加了神经干细胞移植治疗ALS的一期临床试验。人类神经干细胞常规性采集自妊娠至少八周后自然流产的宫内死胎的前脑;该临床试验中使用的2个人类神经干细胞系分别来自妊娠后15周和16周的自然流产死胎,在试验中随机使用。神经干细胞经培养和增殖后,未经进一步诱导和分化,使用与美国神经干细胞公司相同的外科技术(包括手术操作方法、立体型架固定/微量注射装置和免疫抑制方案等)移植进入应试患者腰椎的脊髓前角。术后连续18个月的不良反应和疗效监测显示,该神经干细胞制剂及移植技术安全,但是不能减慢应试患者ALS病情(ALS病情指数和肺功能)的发展,尽管3名患者反映了短暂而轻微的行走功能(1-3个月,1分)和胫前肌肌力(7个月,1分)的改善。IV.捷克查尔斯大学第二医学院:自体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS26名应试ALS患者(18-65岁、预期存活时间超过2年、满足ALS病情要求、肺功能在70%以上、确定的散发性ALS患者)参加了自体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS的一期和二期临床试验。从ALS患者自体的骨髓中提取、分离出间充质干细胞并培养、增殖,但不经进一步诱导分化,然后将其通过腰椎穿刺的移植途径(单次)注射进入患者的脑脊液中。试验结果表明,细胞制剂和移植方法对患者安全,30%患者感觉到轻度至中度的头痛只与腰椎穿刺相关。对应试患者的ALS病情发展进行了6个月的术前监测和18个月的术后跟踪。对ALS病情指数的监测结果发现,应试患者的病情发展在术后3到6个月内明显减慢,但在术后9到12个月内与预测的下降速度没有显著差异。也就是说,从ALS病情指数的变化来看,该干细胞移植在术后短时间内有暂时的减慢病情发展的效果,但从长时间来看没有减慢病情发展的效果。研究者的另一项实验结果显示,骨髓来源的间充质干细胞在脑脊液及中枢神经系统中的存活时间不超过2周;进而研究者认为多次细胞移植可能延长该项技术减慢ALS病情发展的时间。对监测结果进行进一步的分析发现,该干细胞移植对病情快速发展的患者在术后12个月内都有显著减慢病情发展的效果,但对病情缓慢、稳定发展的患者则没有任何效果。对肺功能的监测结果发现,术前和术后肺功能的下降速度没有发生任何变化。研究者认为肺功能的检测结果更客观、准确,因为ALS病情指数测定准确与否和被测患者当时的精神状态有很大关系,并受测试医生主观认定的影响。V.美国梅奥医学中心:自体脂肪间充质干细胞移植治疗ALS27名应试ALS患者(年龄在18岁以上、肌力下降在1年以上/2年以内、肺功能在65%以上、不使用呼吸机、确定的ALS患者)参加了自体脂肪间充质干细胞移植治疗ALS的一期临床试验。从ALS患者自体腹部的脂肪组织中提取、分离出间充质干细胞并经过8周以上的培养、增殖,但不经进一步诱导分化,然后将其通过腰椎穿刺的移植途径注射进入患者的脑脊液中。术后连续24个月的不良反应和疗效监测显示,细胞制剂和移植方法对患者安全:以腰疼和腿痛为主的不良反应只发生在最高剂量组的应试患者身上,磁共振结果显示没有肿瘤发生。但是,自体脂肪间充质干细胞移植不能减慢应试患者ALS病情(指数)的发展,尽管半数应试患者报告了短暂(不超过2个月)而轻微的肌力和肌肉功能提高等症状改善。该一期临床试验起始于2012年6月,其后继的二期临床试验起始于2017年10月,计划招募60名ALS应试患者(年龄在18岁以上、肌力下降在2年以内、肺功能在65%以上、不使用呼吸机、服用利鲁唑但不服用任何中草药、住所距离试验医院较近、可疑、可能或确定的ALS患者)。二期临床试验为单组、非盲、多地(明尼苏达州、亚利桑那州和佛罗里达州的梅奥医学中心)试验,计划在一年内对应试患者分4次进行细胞移植、每次间隔3个月。VI.其他间充质干细胞移植治疗ALS的(FDA)一期和二期临床试验(未公布结果)1,西班牙安达卢西亚新疗法计划:自体脂肪,52人;多地、安慰剂对照、三盲;静脉滴注。2,波兰摩萨克斯基医学研究中心:自体脂肪,30人;1次脊髓显微注射+2次腰椎穿刺。3,台湾中国医药大学医院:自体脂肪,1人;先导性,1次脑外科移植+4次静脉滴注。4,伊朗罗扬研究所:异体脂肪(间充质干细胞来自健康供体的脂肪组织),19人;静脉滴注。5,波兰瓦尔米亚玛祖里大学:自体骨髓,30人;1次或3次细胞移植;腰椎穿刺。6,伊朗罗扬研究所:自体骨髓,6人静脉滴注,8人腰椎穿刺。7,巴西圣保罗大学总医院:自体骨髓,28人;2次细胞移植,间隔1个月;腰椎穿刺。8,中国武警总医院:脐带血,30人;4次细胞移植,每次间隔4天;腰椎穿刺。九以上比较全面地回顾了目前干细胞移植治疗ALS的(已完成和进行中的)临床试验。这些临床试验都是比较靠谱的:1,在FDA登记的临床试验,(除中国外)均由知名医院承担,严格满足相关要求和规范;2,都有在ALS动物模型上的临床前试验、甚至针对实际患者的先导性临床试验作支撑;3,此类临床研究已先后开展了20年,前人丰富的经验对新试验的设计有很好的指导;4,此类临床试验最终以应用为目的,投入巨大,从试验设计到数据分析都安全、可靠。因此,对这些临床试验的回顾可以给我们带来很多启示。——对干细胞移植治疗ALS,目前我们能期待什么?前面说过,治疗ALS有三种程度:彻底治愈、停止发展和减慢发展。要彻底治愈ALS需要:1,阻断对运动神经元最主要的致病因素/毒害作用。由于目前还没有找到,因此很难做到;2,新运动神经元的再生,替换已凋亡的。目前体内再生这种长轴突的神经元还无法做到。而目前干细胞介入疗法和小分子药物所能做到的,只有:3,改善运动神经元的微环境,包括神经营养、代谢保护、抗炎作用和免疫调节等。显然,前两点是雪中送炭,相比较第三点只是锦上添花。所以,可以说目前干细胞移植治疗ALS只能,或多或少地,减慢病情的发展。——为什么说目前干细胞移植治疗只能减慢ALS病情的发展?1,作用机理决定:只能改善微环境,不能阻断致病机制,也不能再生运动神经元;2,也是从20年临床试验的疗效结果得出的结论;3,在ALS动物模型上进行的临床前试验只能延缓起病时间和减慢病情发展。——细胞移植治疗ALS所用的细胞类型总结归纳这些临床试验的细胞来源和疗效可以发现,主要使用了3种细胞类型:1,自体骨髓或脂肪来源的、未经诱导分化的间充质干细胞。这类干细胞比较容易获得和制备,但从作用机理来看改善运动神经元微环境的能力相对比较有限,从临床试验的疗效结果来看最多只能短期内减慢ALS病情指数的下降,不能减缓肺功能的下降或在长期上减慢病情的发展。这可能跟这类干细胞在中枢神经系统中分化能力有限和存活时间较短有关。前面也说过,自体干细胞有个性化定制的意味,不能当成成品随需随用;制备需要一个时间周期,制备过程也很难标准化,而且价格相对更昂贵。同时,也不能规避掉自体干细胞中固有的遗传缺陷,(因为移植途径的原因)在免疫排斥方面的优势也不明显;且老年人自体间充质干细胞的质量也随年龄增长呈下降趋势,增殖和分化能力都显著退化,而这个年龄的人群正是ALS的高发人群。最后,值得注意的是在过去20年的临床试验中,无论自体还是异体来源,国外均未使用过胎盘或脐带血来源的间充质干细胞治疗ALS。最后,都是间充质干细胞,骨髓和脂肪来源的哪个更好?骨髓和脂肪来源的间充质干细胞具有相似的分化能力和细胞表面标志物表达谱,但是在蛋白分泌模式和表面标志物种类上也有差异。研究发现相比较骨髓来源的间充质干细胞,脂肪来源的间充质干细胞具有更好的增殖能力和更大的免疫调节潜力,以及表达更多对间充质干细胞归巢至关重要的趋化因子受体。2,胚胎来源的、未经诱导分化的神经干细胞。国外临床试验机构使用的是真正来源于中枢神经系统的神经干细胞,而不是其他干细胞来源的、经有限的诱导分化而成的所谓神经祖细胞或神经前体细胞。这类干细胞相比较不容易获得,相关研究也比较滞后,但是它在中枢神经系统中的分化能力明显高于间充质干细胞,研究结果显示其存活时间也非常长。由于神经干细胞不具全能性,因此理论上成瘤性较低,使用的安全性较高,研究结果也证实了这一点。也许研究者的期待较高,希望神经干细胞在行使神经营养和保护功能时能尽可能地接近其目标对象——运动神经元,甚至希望其能再生出新的运动神经元,因此在相关临床试验中都采用了摘除椎板后微量注射到脊髓实质的移植手段。这种移植技术手术过程复杂,入侵性很大,给应试患者带来较大痛苦。遗憾的是,相关临床试验均未显示任何显著疗效。3,完全或部分分化的细胞,例如胚胎干细胞来源的星形胶质细胞、及自体骨髓间充质干细胞经诱导后分化而成的分泌神经营养因子的间充质干细胞(我估计此时已具有一定星形胶质细胞的性质)。这类细胞制剂最大的优势,就是能更好地行使被期待的功能——对运动神经元提供神经营养、代谢保护、抗炎作用和免疫调节等功能。目前细胞移植治疗ALS的基本原理,终归是为运动神经元创造一个有利的微环境,中和有害物质、抵消有害因素,平衡微环境中的化学组分和代谢过程。运动神经元的胞外环境主要由神经胶质细胞构成,而其中星形胶质细胞又占主导;由此可见,在周围重建一个健康的星形胶质细胞群体将是支持和保护受损的运动神经元最好的选择之一。——有效的细胞移植途径总结归纳这些临床试验的细胞移植途径可以发现,主要使用了3种移植技术:1,静脉注射或静脉滴注:目前已经基本被废用。由于血脑屏障的阻碍,由外周血输入的细胞很难到达中枢神经系统退行性病变的病灶,递送效率极低,还会滞留在肺部等器官处,并可能引发免疫排斥反应,因此是干细胞技术治疗ALS效果最差的移植途径。2,腰椎穿刺:治疗ALS使用最广的细胞移植途径;简单易行,一般医院都能实施的标准化操作。可将细胞制剂递送到距离运动神经元比较接近的部位,还可随脑脊液的循环流动而扩散到整个中枢神经系统,符合ALS分散性病灶的特点。由于可以绕过血脑屏障直达患处而不与血液接触,因此可以最大程度上避免免疫排斥反应的发生。当然,移植细胞最终的命运和归宿还与细胞自身的存活和归巢能力有关。3,基于椎板摘除术的脊髓前角微量注射:难度最大的细胞移植技术,只在神经干细胞移植治疗ALS的临床试验中使用过。手术中使用的金属立体固定型架和微量注射装置虽然在大型动物手术中标准化使用,但是使用在人身上还属首次;目的是将细胞制剂尽可能接近地递送到运动神经元周围狭小的区域内,以最大化地发挥其潜在的功能。手术过程复杂,入侵性很大;如果意外伤及运动神经元,还可能加速ALS病情的发展。——目前细胞移植治疗ALS临床试验存在的一些问题:1,绝大多数是以考察细胞制剂和移植技术安全性为主要目的的一期和二期临床试验,试验样本数量较少,又大都是无对照组的非盲试验,因此短期疗效的试验结果在统计学上意义不大,所报告个别应试患者术后病情变化的准确性也不高。尤其是缺乏应试患者存活时间的长期监测结果,不像利鲁唑或依达拉奉,因此无法判断其长期疗效究竟如何。对于ALS患者来说,接受细胞移植治疗,受了这么多苦,花了这么多钱,究竟能延长几个月的生存时间?2,ALS患者的病情具有典型的异质性,通俗讲就是五花八门,发病年龄、发病症状、遗传背景、发展速度、存活时间等在不同的患者间存在较高的多样性。目前的临床试验对应试患者的选择标准往往过于宽泛,对其不同亚型或类别的分组不够,因此今后在确定细胞移植疗法的适用患者范围时会受影响,甚至会影响临床试验的成功率。有些临床试验的疗效结果经进一步的深度分析后发现,该细胞移植疗法对病情快速发展的患者、或对比较年轻的患者才有较为明显的疗效。3,临床试验的疗效结果往往不如在ALS动物模型上完成的临床前试验的疗效结果乐观。这里,让我们首先了解一下这个经常出现的“ALS动物模型”。在若干导致家族性ALS的变异基因中,SOD1基因变异致病被最先发现。没错,这个SOD就是“要想皮肤好,天天用大宝”中用的大宝SOD蜜中的SOD——超氧化物歧化酶。于是美国西北大学的研究者将人类导致家族性ALS的SOD1突变基因以多拷贝的形式转基因进入小鼠(及大鼠),发现小鼠(及大鼠)也产生了类似人类ALS的病理表现——这个小鼠(及大鼠)就是后来被广泛应用的ALS动物模型。家族性ALS占ALS总发病率的5-10%,而SOD1基因突变占家族性ALS的20%,也就是说只占ALS总发病率的1-2%。考虑到ALS发病的高度异质性,在分子水平上和临床试验中,ALS动物模型可能与绝大多数实际中的ALS患者还存在着较大差异。另外,临床前试验通常在ALS动物模型发病以前就进行细胞移植,然后观察实验动物发病时间的推迟和存活时间的延长等,这与实际中ALS患者的情况又有较大差异,因为他们通常在起病数月后才被诊断出ALS,而能采用细胞移植疗法的时间就更迟了。这两点差异可能导致了前面提到的临床前试验和临床试验间的疗效差异。——如何提高细胞移植治疗ALS的疗效?对以往研究的分析、总结、归纳和综述,最终目的都是为了温故知新。然而这个问题也是困扰着所有研究者的大问题,目前还没有答案。在此,只说一些我个人的非常浅薄的想法。1,只增殖、未分化的干细胞(比如骨髓和脂肪间充质干细胞)本身在中枢神经系统中不能直接发挥与治疗ALS相关的特异性功能,比如神经营养和保护等;它们在被移植到脑脊液中后所能发挥相关功能,都是在经过体内环境的诱导和一定程度的分化后。同时,它们在脑脊液中的存活时间较短,在能够充分分化并发挥神经营养和保护的作用以前,可能已经凋亡或被清除。因此,从发挥特异性功能的速度和能力、以及在中枢神经系统中的存活时间等角度来看,直接简单粗暴地使用未分化的干细胞(除神经干细胞外)制剂治疗ALS不是一个很好的选择,而临床试验的疗效结果也证实了这一点。相比较,移植已经充分或部分分化的、具有神经细胞性质的细胞制剂进入脑脊液,由于它们与中枢神经系统的相容性更好、存活时间更长、归巢能力更好、发挥特异性功能更快、发挥作用的能力更强,因此可能是治疗ALS的一个更好的选择。移植包括星形胶质细胞在内的神经胶质细胞可发挥比较明确的多效性,神经营养因子、抗炎因子、免疫调节因子、抗凋亡因子、及其他有益的细胞因子一起上,尽可能地抵消掉ALS主要致病因素下游尽可能多的毒害作用,从而最大限度地减慢病情的发展。为能更好地在运动神经元周围营造出一个健康、平衡的微环境,甚至可以以“鸡尾酒”的形式向脑脊液中联合移植由干细胞分化来的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞等多种神经胶质细胞。2,当ALS患者最初发觉肌力下降时,50%与该肌力相关的运动神经元已经死亡。运动神经元是永久细胞,成年后一旦死亡很难再生,但是任何一个确定的ALS患者都期待运动神经元可以再生、以替代死亡的运动神经元指挥肌肉自主运动,而干细胞无疑是承载运动神经元再生使命的最佳候选。全球第一个成功上市的治疗ALS的干细胞制剂取名NeuroNata,实际上就是“神经”和“出生”两个词的组合,体现了韩国核心干细胞公司对该产品的期望。(尽管该自体骨髓来源的间充质干细胞制剂并不能诱导运动神经元的再生。)所以,在细胞移植治疗ALS的基础研究和临床试验上,应该“运动神经元的营养和保护”、及“运动神经元的再生”两手都要抓,而且两手都要硬。尽管神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位,神经胶质细胞对神经系统的形态建成及功能发挥也起着不可或缺的作用。神经胶质细胞能够参与指挥神经元的发育,就像葡萄架引导葡萄藤生长一样,甚至可以精确地控制神经元的生长位置和分化方向。因此,将胚胎干细胞诱导分化成运动神经元祖细胞(可分化、发育成新的运动神经元并可与宿主的神经元形成突触),以及类似胚胎发育早期、运动神经元发生时的神经胶质细胞(可以促进和引导运动神经元的发育),并将2种细胞联合移植到脊髓前角及脑干等部位,可以用来探索运动神经元体内再生及替换的可能。此时,若采用通过腰椎穿刺将细胞制剂递送到脑脊液中的移植手段可能已不再合适;但是即便可以精准地将细胞制剂移植到靶标部位,基于椎板摘除术的微量注射技术的入侵性也过强,给ALS患者带来的痛苦和风险也太大。采用先进的三维医学影像平台进行微创的显微注射,将细胞制剂精确递送到脊髓实质和脑室的指定位置,可能是细胞移植方法更好的选择。十实际上,干细胞移植技术治疗ALS的临床试验很早就曾在我国开展,当时处于世界同行的前列。最早在2003至2005年间,就由樊东升教授主持、王丽平博士负责、北医三院和北京大学干细胞中心合作实施了自体骨髓间充质干细胞移植治疗ALS的临床观察。从ALS患者自体的骨髓中提取、分离出的间充质干细胞经体外培养、增殖,但不经进一步诱导、分化,再通过腰椎穿刺的移植途径注射进入同一患者的脑脊液中,或通过肌肉注射的移植途径递送到患者外周运动神经元的附近。试验结果表明,该细胞疗法的安全性尚好,术后短期内有减慢病情发展的效果,但从长期监测的疗效来看,对应试患者的预后和生存期没有特别的作用。该临床试验在我国属首例,对相关的临床研究和转化应用都具有很高的价值,但遗憾的是因为种种原因,该临床试验未能在美国国家卫生研究所(NIH)进行登记,其结果也未能得以发表。实际上,我国在干细胞基础研究领域、尤其是将干细胞诱导、分化成为神经元及神经胶质细胞等方面也很早就处于世界领先地位。例如早在2009年,复旦大学张素春教授就开发出了可以高效地将人类胚胎干细胞或诱导性多能干细胞诱导、分化成为功能完好的运动神经元的方法,并发表在《自然》杂志子刊《自然-实验方法》上。2011年,张素春教授又在《自然》杂志子刊《自然-生物技术》上发表论文,介绍了其实验室首创的、可以高效地将人类多能干细胞诱导、分化成为星形胶质祖细胞的技术。无奈在我国,基础研究和临床转化之间始终存在着巨大的落差,倒是以色列卡迪玛干细胞公司利用相关技术,在若干年后成功地开发出了分化自人类胚胎干细胞的星形胶质细胞制剂AstroRX并进行了临床试验。希望我国能在干细胞移植治疗ALS领域重启基础研究和临床试验,而大专院校实验室、生物技术公司和医院三方结合、共同攻关显然是必经之路;我国国情决定了这其中医院、尤其是正规的大医院、特别是像北京协和医院和北医三院这样在ALS诊断和研究领域专业化的大医院,应该成为驱动该领域快速起步、弯道超车的原动力。再次感谢Christian辛苦原创,也非常希望能给患者朋友带来更多的帮助。
医学是一个很复杂的过程,每个疾病的诊断都是需要抽丝剥茧认真考虑的,即便是一个感冒,鉴别诊断都很可能有很多,更何况很多专业性比较强的疾病,比如 运动神经元病。在咨询中,我接触了不少患者,因为一点点的“肉跳”,开始百度搜索,结果不得了,搜索的结果指向了一个非常可怕的疾病,于是乎惶惶不可终日,每天在痛苦紧张当中无法自拔,而且对照着疾病每天给自己更多的负面心理暗示,感觉活不下去了。于是各种检查各种咨询,但是最关键的是根本听不进去医生的解释说明,一个医生解释过了,告知不是运动神经元病;不信,于是再去找第二个医生;三个五个医生都说了不是,但是总有个别的非常谨慎的医生会告知:不好说,定期复查吧。这个嘱咐本身没有问题,问题出现在这些患者非要愿意带上显微镜去揣摩医生的这句话是否意味着确诊的判断......这样的自我“诊断”要不得,特别是对于相对罕见的疑难疾病,只会给自己增加惶恐,不解决任何问题。对于运动神经元病的诊断,至少需要以下四个方面;第一,典型的症状,这里的症状是指因为肌肉萎缩无力而导致的功能受限,比如,有些人是上肢远端(手)起病的,往往会出现持筷不能,拿不了筷子,吃饭时受影响;或是不能拧开瓶盖儿,不能拿钥匙开门,等等。而有很多人完全没有上述无力感就非常强调自己的“肌肉萎缩”,给医生展示的照片也往往挑选他们认为的角度,但是并不符合实际观察的要求。所以,这时医生往往会建议就近医院门诊进行检查一下。第二,典型的体征,在医院门诊,医生面对面给患者进行检查时,会发现比较明确的肌肉容积是否有变化,即客观评估是否有肌肉萎缩,还是因为过度紧张茶不思饭不想而致消瘦(脂肪消耗为主),还可以判断肌力情况,腱反射情况,病理征等等,这些都是客观检查,是非常重要的一部分内容,而且是不能被其他辅助检查所替代的。第三,相关辅助检查。这些辅助检查包括:影像学检查,如CT/MR等,有抽血化验,也包含肌电图。肌电图是非常重要的检查项目,但是绝对不是单独根据肌电图就能简单判断疾病的。而且肌电图检查需要有经验的检查医生做耐心细致的分析,很多时候是需要复查的。经常有患者咨询时只给一张肌电图的照片,让做出诊断,这里只想说“实在是做不到啊”第四,病情的发展演变。众所周知,运动神经元病是神经系统变性病,到目前为止,尚没有找到阻止病情进一步发展的好的治疗方法,但是有一些和运动神经元病有类似表现的其他疾病则有可能会有病情的波动好转等,所以定期随访观察就显得格外重要。比如,我的咨询患者中有“感到全身肉跳20余年,每年肌电图检查都是正常情况”单单从病情演变来看,就不考虑运动神经元病了。总之,有一个原则,有病不怕病(比如很多人不理解焦虑抑郁,实际焦虑也好抑郁也好,是疾病,不是过错,而且是有相应治疗方法的疾病,不要讳疾忌医),没病不找病(运动神经元病是一个非常罕见的疾病,不要自己瞎琢磨,自己吓唬自己呃)
相比较于过去的20年,近5年来似乎对运动神经元病的治疗方面有更多更有潜力的发现。美国马萨诸塞州总医院Sabrina Paganoni团队研究了苯丁酸钠联合牛磺熊去氧胆酸治疗肌萎缩侧索硬化症的疗效。2020年9月3日,《新英格兰医学杂志》发表了该成果。实验模型发现苯丁酸钠和牛磺熊去氧胆酸可减少神经元死亡。尚不清楚这两种化合物治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者的疗效和安全性。在这项多中心、随机、双盲试验中,研究组共招募了137名明确的ALS患者,病程在18个月内,将其按2:1随机分配,其中89名接受苯丁酸钠-牛磺熊去氧胆酸治疗,48名接受安慰剂治疗。主要结局是24周内肌萎缩侧索硬化功能评分量表(ALSFRS-R;范围0-48,分数越高表示功能越好)的总分下降率。在改良的意向性治疗分析中,接受联合药物治疗组患者的ALSFRS-R得分平均变化率为每月降低1.24分,而安慰剂对照组为每月降低1.66分,组间差异有统计学意义。两组间次要结局均无显著差异。联合药物治疗的不良反应主要为胃肠道反应。研究结果表明,采用苯丁酸钠-牛磺熊去氧胆酸治疗ALS患者24周,ALSFRS评分下降慢于安慰剂组。有必要进行更大范围和规模的试验来进一步评估其疗效和安全性。这段文字是这个研究的摘要,那么对于患者应该怎么理解呢?1,在为期24周(半年时间)的研究中,接受苯丁酸钠联合牛磺熊去氧胆酸治疗的肌萎缩侧索硬化症患者病情发展的要慢了一些。这是由运动神经元病评分分值下降的多少来进行的客观的评估。但是,病情仍然是在进展的,这项治疗并非逆转了疾病的过程。2,对于研究中的“次要结局”,其实包括了不少内容,次要结果为等长肌力下降率、血浆磷酸化轴突神经丝H亚单位水平和缓慢肺活量;死亡时间、气管切开或永久性通气等,在这些方面,联合治疗组并未显示出更多的收益。3,这是一个很好的尝试,但是并不意味着所有的患者现在马上就要开始苯丁酸钠联合牛磺熊去氧胆酸治疗,一来国内尚没有苯丁酸钠的上市药物,国外代购需要可靠的渠道并且价格非常昂贵;二来实验中的剂量相对比较大,胃肠道不良反应的发生也是需要注意的。4,已经有患者来咨询药物的使用,在这里我个人还是比较谨慎,我只能说,在这个研究中,所有的患者都是发病18个月内的,具体服用药物的过程:第一周到第三周,每天服用3g的苯丁酸钠和1g的牛磺熊去氧胆酸,一次服用;三周后,每天服用两次。5,其实可以让子弹再飞一会儿,这个研究提示有必要开展更长时间和更大规模的试验,以进一步证实苯丁酸钠联合牛磺熊去氧胆酸治疗ALS的有效性和安全性。完成双盲试验的受试者已经进入开放标签的扩展试验(CENTAUR-OLE试验),给药至132周,该试验预计2021年初结束,我们可以到时候再确认一下联合治疗的安全性和有效性。无论如何,对于运动神经元病患者来说,这都是一个好消息。(视频来源于丁香园医学网站,侵删。)
谁也没有料到2020年的春天,会是以新冠肺炎的肆虐为开端的,而且到现在为止,还不知道最终会对我们的生活带来哪些变化。但是,我能确认的是,现在到北医三院就诊,已经无法现场加号而是需要而且必须是提前预约了。我想至少有一下三个方法可以进行预约挂号:第一,搜索“线上医疗服务”,安装这个app,然后注册认证,之后按照自己的时间选择,可以提前三天预约;第二,打开手机微信,搜索“北医三院服务号”,下方可见“导诊服务”,可“预约挂号”,之后选择科室,提前预约。以上两种方法可以提前三天,实名预约,而且可以直接确认预约的医生信息。还有一个方法,即通过114电话预约,可以提前7天预约,但是不能确认到底预约的是哪个医生。在其次,则可以在门诊现场,虽然是不能现场加号了,但是可以现场预约下次就诊时间,不过需要跑两趟医院。或是在“线上医疗服务”中与想要预约的医生沟通,线上提前预约好,再按照预约时间过来就诊。希望疫情赶紧过去,希望一切恢复常态。
熊去氧胆酸熊去氧胆酸是一种亲水性胆酸——中药熊胆中的主要成分,是目前治疗原发性胆汁性肝硬化主要的、也是唯一通过美国FDA审批的药物,还被广泛用于治疗包括原发性硬化性胆管炎和进行性家族性肝内胆汁淤积等在内的胆汁淤积型肝脏疾病。熊去氧胆酸及其衍生化合物牛磺酸熊去氧胆酸,可以通过稳定线粒体内膜、调控细胞凋亡途径上游靶标的表达、抑制细胞凋亡途径最上游的半胱天冬酶的激活等作用来抑制细胞凋亡,尽管其具体的作用机理尚不十分清楚。熊去氧胆酸所具有的抗细胞凋亡、免疫调节和抗氧化等作用可能被用于治疗ALS,但是用于治疗肝脏疾病的熊去氧胆酸胶囊或片剂含有酸性晶体,在酸性环境中溶解度极低,最终只能在小肠中经被动的非离子扩散被稀释和吸收,而且大部分会在肝脏中与甘氨酸或牛磺酸结合后随胆汁排出,因此很难进入中枢神经系统。后来开发的熊去氧胆酸口服增溶剂型可以克服这些缺点,使熊去氧胆酸可以高效地进入到脑脊液中,为其治疗ALS创造了机遇。早先的一项来自明尼苏达大学医学院的研究结果显示,口服剂型的熊去氧胆酸可以通过血脑屏障进入ALS患者的脑脊液中。熊去氧胆酸治疗ALS的III期临床试验起始于2005年3月,结束于2007年7月,试验为单中心、双盲、随机、交叉分组、安慰剂对照。共有80位ALS患者参加了试验,应试患者需满足以下条件:年龄>=20岁;发病=<5年;Appel量表指数在40~120之间;肺功能>=30%;可能或确定的散发性ALS患者。试验设计为交叉分组:先经过1个月的导入期;然后A组服药3个月,每天服用3.5克熊去氧胆酸/140毫升,B组服用安慰剂;之后为1个月的洗脱期;然后进行交叉——A组服用安慰剂,B组服药。对于这样的小样本数量临床试验,采用交叉分组相对于传统的平行分组的一个主要优势是,交叉分组方案可以尽可能地减小应试患者人群内部的系统误差。研究者采用交叉分组的另一个原因是出于医学伦理考虑——通俗地讲,就是阳光普照、来者有份儿,任何一个参加试验的应试患者都可以接受熊去氧胆酸的治疗。当然,这是建立在确信熊去氧胆酸对ALS患者具有正效果的基础上的——如果熊去氧胆酸对ALS患者具有负效果,那么到头来谁也跑不掉。在80位ALS应试患者中,最后A组有13位、B组有6位患者最终完成了试验;完成试验的应试患者共有19位,不足起始时人数的四分之一。应试患者极高流失率的原因包括:不符合统计分析条件,失去联系,不能按时随访,病情迅速恶化和因不良反应退出试验等。主要的不良药物反应均为消化道反应,包括腹痛、神经性厌食、腹泻和呕吐等。研究者认为应试患者基本上可以耐受熊去氧胆酸,但是患有急性胆囊炎或胆管阻塞等肝胆疾病的ALS患者,使用熊去氧胆酸时应抱有特别谨慎的态度,遵医嘱服用。在8个月的试验期内,应试患者共接受了4次终点事件检测。该项III期临床试验的结果显示,应试患者ALS病情指数和肺功能的变化,在熊去氧胆酸服药组和安慰剂对照组之间没有显著差异,说明熊去氧胆酸对治疗ALS无效。但是和对照相比较,熊去氧胆酸服药组应试患者Appel量表指数下降减缓了1.17点/月,说明熊去氧胆酸在该检测指标上可以减缓ALS应试患者的病情发展速率。在抽检的应试患者的脑脊液中均检测出了熊去氧胆酸的含量。研究者也承认,这是一项总体质量较差、可信度较低的临床试验,根本无法得出确定的结论;除了应试患者人数较少、熊去氧胆酸服药时间较短和终点事件检测时间点较少等显而易见的因素外,最主要的问题就是极高的应试患者流失率。研究者在报告中指出,导致大量应试患者纷纷退出试验的一个主要原因是因为这些患者的病情发展加快,因此不愿意再继续服药。同时,本着诚实的态度,研究者也强调了16名应试ALS患者服用熊去氧胆酸后病情发展显著加快(大于8点/月),而这些患者的试验数据被最终排除在统计结果之外!因此,综合考虑以上两点的话,熊去氧胆酸在该项III期临床试验中对ALS的疗效肯定会更加悲观。该项临床试验未在美国FDA登记,熊去氧胆酸使用在ALS治疗上也未经过美国FDA批准;其研究结果于2012年发表在《韩国医学杂志》上。牛磺酸熊去氧胆酸相比较熊去氧胆酸,对牛磺酸熊去氧胆酸的研究就要多得多。牛磺酸熊去氧胆酸也是一种亲水性胆酸,是熊去氧胆酸在人体肝脏中与牛磺酸相结合的内源性产物,被广泛用于治疗慢性胆汁淤积型肝脏疾病及胆结石等。牛磺酸熊去氧胆酸还在帕金森症、亨廷顿症、阿尔茨海默症、缺血性和出血性脑卒中等疾病的动物模型中展现出神经保护功能,相关体内和体外试验都显示出牛磺酸熊去氧胆酸在以细胞凋亡为病理特征的急性和慢性退行性神经病变中的抗细胞凋亡作用——牛磺酸熊去氧胆酸的这些特性暗示其可能被用于治疗ALS。牛磺酸熊去氧胆酸治疗ALS的II期临床试验为慈善组织资助,非商业组织行为。试验开始于2008年6月,结束于2012年4月,为三中心、双盲、随机、平行分组、安慰剂对照。共有34位ALS患者参加了试验,其中29位应试患者(15位牛磺酸熊去氧胆酸服药组和14位安慰剂对照组)最终完成了试验。应试患者需满足以下条件:年龄18~75岁;发病=<1.5年;肺功能>=75%;服用利鲁唑;四肢起病;可能或确定的ALS患者。试验方案为:先经过3个月的导入期;然后应试患者服药1年,每天2次、每次1克牛磺酸熊去氧胆酸;每1.5个月进行一次病情监测。该项临床试验的主要终点事件为药物响应者(对比导入期,ALS病情指数的变化斜率改善至少15%)的百分比,次要终点事件包括和安慰剂对照相比较的疗效(ALS病情指数和肺功能等的变化)、应试患者生存期和不良反应等。试验结果显示,牛磺酸熊去氧胆酸可以被应试ALS患者耐受,不良反应在两组之间没有显著差异;主要的不良药物反应均为消化道反应,其发生几率与以往牛磺酸熊去氧胆酸治疗肝胆疾病的临床试验中相仿。在该项III期临床试验的疗效结果中,药物响应者百分比为:服药组87%,对照组43%(P=0.021);在试验结束时,相对基线校正后的ALS病情指数为:服药组23.3,对照组16.3(P=0.007);说明牛磺酸熊去氧胆酸可能延缓ALS患者的病情发展。就ALS病情指数的4个分项:下肢运动、上肢运动和呼吸功能的变化在两组之间没有显著差异;而对于球部功能的病情发展而言,服药组显著慢于对照组。但是肺功能的变化在两组之间没有显著差异。在试验结束后66周的随访结果显示,应试患者的平均生存期为:服药组65.7周,对照组61.1周。经过换算,联合服用利鲁唑和牛磺酸熊去氧胆酸1年可以延缓ALS患者病情发展约4~5个月。该项研究成果于2015年发表在《欧洲神经学杂志》上。从以上两项临床试验的结果来看,牛磺酸熊去氧胆酸对ALS的疗效似乎比熊去氧胆酸更乐观一些。在美国FDA的临床试验数据库中,针对治疗ALS尚没有任何熊去氧胆酸的临床试验做过登记,但是已经登记了4项牛磺酸熊去氧胆酸的临床试验;这么看来,应用牛磺酸熊去氧胆酸治疗ALS的临床研究似乎更活跃一些。这4项临床试验的基本情况如下:1、意大利IRCCS基金会卡洛贝斯塔神经学研究所(上述)2、意大利Humanitas公司试验周期为2019年2月22日至2021年6月30日,试验设计为多地、双盲、随机、平行分组、安慰剂对照、联合使用利鲁唑和牛磺酸熊去氧胆酸的III期临床试验,为上述1的后继临床试验。将有440位应试ALS患者参加,患者要求发病<=1.5年,体重40公斤以上,肺功能>=70%,不使用呼吸机,吞咽无障碍(ALS病情指数分项为满分),服用利鲁唑但不使用依达拉奉,无胆囊疾病。试验方案为3个月的导入期后,每天饭后10~15分钟内服用牛磺酸熊去氧胆酸胶囊2次,每次1克,共服药1.5年;每3个月监测一次终点事件指标,包括响应人数、存活期、ALS病情指数、肺功能等生理指标,及神经纤维水平等分子指标。3、美国Amylyx公司试验周期为2017年6月22日至2019年12月,试验设计为多地、双盲、随机、安慰剂对照的II期临床试验,旨在考察联合使用牛磺酸熊去氧胆酸和苯基丁酸对ALS患者的安全性、以及能否延缓病情的发展。共有132位应试ALS患者参加,患者要求发病<=1.5年,肺功能>=60%,服用利鲁唑与否均可,无胆囊疾病或肝功能低下。试验方案为每天服药2次,每次服用牛磺酸熊去氧胆酸1克和苯基丁酸3克,共服药6个月;检测的终点事件指标包括不良反应、存活期、ALS病情指数变化、肺功能等生理指标,及血液检测和医学影像等细胞分子指标。4、美国Amylyx公司试验周期为2018年3月29日至2020年1月1日;该项临床研究是上述3的后继试验,旨在考察联合使用牛磺酸熊去氧胆酸和苯基丁酸后对ALS患者的长期安全性和疗效,因此试验设计为多地、非盲、单组的II期临床试验。监测对象为上述3中服药的应试患者,检测的终点事件包括长期不良反应、ALS病情指数、肺功能、住院次数、胃造瘘情况和气切情况等。甘氨酸熊去氧胆酸熊去氧胆酸仅占人体总胆酸排出量的4%;前面提到过,熊去氧胆酸在肝脏中被转化为牛磺酸熊去氧胆酸和甘氨酸熊去氧胆酸,而后者的转化量远远大于前者。研究显示,牛磺酸熊去氧胆酸和甘氨酸熊去氧胆酸具有和熊去氧胆酸相同的神经保护作用,因此一个葡萄牙的研究组将治疗ALS的临床前试验聚焦在甘氨酸熊去氧胆酸上。该项研究使用了一个ALS的细胞模型,即过表达人类SOD1G93A突变基因的运动神经元样细胞系NSC-34,而它是由小鼠的成神经细胞瘤细胞和分化自小鼠干细胞的运动神经元杂交而来。体外试验结果显示,当用甘氨酸熊去氧胆酸处理NSC-34时,NSC-34的ALS病理表型发生了变化:细胞质中的SOD1包涵体减少了,线粒体损伤减少了,半胱天冬酶-9的激活及细胞凋亡都下降了;细胞外的硝酸盐浓度下降了,金属蛋白酶-9的激活减少了。这些结果说明甘氨酸熊去氧胆酸可能被用来保护运动神经元、延缓ALS的病情发展。说不定哪天,甘氨酸熊去氧胆酸也和熊去氧胆酸及牛磺酸熊去氧胆酸一起,加入到延缓ALS病情发展的战队中。
Christian原创科普:渐冻药绝密档案之依达拉奉一、依达拉奉的背景信息依达拉奉是一种自由基清除剂,可以将一个电子传递到脂肪过氧化物或羟基自由基上,将其氧化性中和掉。2001年,依达拉奉通过了日本厚
再次感谢Christian给我们带来的干细胞治疗ALS的信息,希望常在。Christian原创科普:利用人类诱导性多能干细胞(iPSC)筛选治疗ALS的药物一ALS肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种罕见的、迟发的神经退行性病变:大脑和脊髓中的运动神经元由于某种尚不清楚的主要有害因素而遭到破坏并逐渐死亡,因此不能再支配肌肉进行自主运动,进而患者逐渐丧失运动能力,包括由肌肉驱动的语言、吞咽和呼吸能力。1、ALS有多罕见?年发病率约为十万分之1.5,普遍率约为十万分之5。目前的年发病率和普遍率,全球约为12万和35万,欧洲为4988和13500,美国5960和17500,日本约为3000和6000。我国由于医疗体系和医保制度等原因,至今尚无相关的统计数字。2、什么是迟发性?就是起病时间较晚。在欧洲和日本,ALS患者的发病年龄大约在65岁。在我国,北医三院统计发病的平均年龄为49.8岁,中位生存期为5.9年;北京协和医院统计发病的平均年龄约为53岁,实际平均生存期为2.5年。但在80岁后基本不会发病。3、虽然ALS非常罕见,ALS患者的病情却又具有典型的异质性,通俗讲就是五花八门,发病年龄、发病症状、临床表现、发展速度、存活时间、遗传背景等在不同的患者间存在较高的多样性。这就为ALS的临床诊断、基础研究和药物开发提出了极大挑战。4、ALS分为家族性和散发性2种。家族性ALS占总发病率的5-10%,散发性占90-95%。散发性ALS的发病年龄比家族性的小11岁。目前鉴定出和ALS相关的基因突变已有一百多个,已发现导致家族性ALS的突变基因包括C9orf72、SOD1、FUS和TDP-43等,其中C9orf72基因突变占家族性ALS的45%,SOD1占20%。5、值得注意的是,ALS的诊断过程较为复杂、确诊时间较长,通常需要依赖神经科临床检查和问诊、肌电检查、以及对相关一系列病征相近的疾病的排除等间接手段;不像对其他疾病的诊断,可以根据标志物生化指标、和对病灶的医学影像及组织活检等直接证据。同时,ALS具有进行性,早期发展较慢、症状较轻更增加了早期诊断的难度。6、ALS患者的运动神经元在细胞和分子水平上的病理表型包括:因活性氧自由基胁迫或活性谷氨酸毒害等因素导致的细胞死亡、自体免疫反应、神经炎症反应、神经营养因子缺乏、轴突运输缺陷、超兴奋性或低兴奋性、神经肌肉接点功能异常、细胞核质运输功能异常、线粒体功能异常、自体吞噬功能异常、RNA加工错误和蛋白错误聚集等。二iPSC本文题目里的第二个关键词,就是诱导性多能干细胞——iPSC。关于干细胞,我在“干细胞移植技术治疗ALS的临床研究进展”一文中作了比较全面的介绍,在此不再赘述。诱导性多能干细胞(iPSC)是干细胞的一种,它是通过人工启动若干(转录因子)基因的表达或使用化合物分子,诱导体细胞的分化、发育进行重新编程,进而获得的具有类似胚胎早期多能干细胞分子特性、更新能力和分化潜能的一类多能干细胞。多能干细胞可以分化为特异组织的细胞,但是特异组织的细胞可以分化为多能干细胞吗?答案是否定的,除非对充分分化的细胞进行化学或基因表达的诱导。iPSC之父、2012年诺贝尔奖获得者山中伸弥教授通过学习胚胎发育早期的基因表达情况,利用原创的筛选系统,在引入4个转录因子基因的特异性表达后,首次成功地倒转了细胞自然发育的时钟,将皮肤细胞诱导成为具有早期胚胎细胞性质的多能干细胞。那么,iPSC之于ALS,能够有何作用?如果将家族性或散发性ALS患者的体细胞诱导成为iPSC细胞系,它可以帮助:1、解析ALS的致病机理。目前,在ALS中导致运动神经元受损伤的最主要的因素仍未找到,这极大地阻碍了有效治疗ALS的药物和疗法的开发。将iPSC诱导分化成运动神经元(iPSC-运动神经元)及神经胶质细胞等,在保持稳定、清晰的ALS遗传背景下,重塑微观上的病理模型,可以在细胞和分子水平上开展ALS的机理研究。这是iPSC对攻克ALS的宏观作用。在ALS发病后,目前已发现对运动神经元的毒害作用包括:活性谷氨酸积累、氧化胁迫、炎症反应、感染、免疫机制、蛋白错误聚集、神经纤维功能紊乱、激素失调、线粒体功能和RNA加工出错、及轴突运输和神经肌肉接点出现问题等,但这些可能都是下游表型,而不是最上游、最主要的触发因素。这就好似一条凌汛期的大江,如果上游溃坝,下游必将多处受灾;此时即便在下游多方施救,也是事倍功半,不及尽早将上游的大坝修复更有成效。相似地,对于ALS而言,即便对再多的下游表型对症治疗,也是防不胜防,而找到上游起因才是关键。2、找到基因型和表现型之间的对应关系。来自ALS患者的iPSC具有稳定、清晰的基因型;该iPSC-运动神经元是ALS真实、有效的体外病理模型,可以在细胞和分子水平上对其微观表现型进行观察、分析,包括细胞形态、亚细胞结构、生化组成和基因表达等,为确定ALS致病基因型和在运动神经元上对应的表现型之间的关系提供了条件。这一点对散发性ALS的基础研究尤为重要,因为无论是ALS动物模型还是胚胎干细胞系,目前的模式系统都是基于家族性ALS致病基因突变(例如SOD1G93A)的转基因异源过表达。3、发现生物标志物。简单讲,生物标志物就是标记某种生理改变的生化指标;对于ALS而言,可以理解为在患者和健康成人之间,以及在患病运动神经元和健康运动神经元之间存在着某种特异、灵敏而又稳定的差异,这种差异可以被一个易于测量的生化指标所检定和评估,而这个生化指标就是ALS的生物标志物。该iPSC-运动神经元和健康的运动神经元之间经转录组、蛋白组和代谢组比对后,更容易找到针对ALS的生物标志物,进而在ALS的早期诊断、精细分型、病情分期、疗效评估和药物筛选等方面发挥重要作用。4、筛选治疗ALS的药物。这是本文的主要内容,因此将在下面详细展开。实际上对于ALS,iPSC之所以有上述用途,主要是基于以下特点:——丰富的病理模型。前面提到过,虽然ALS非常罕见,从临床上讲却具有高度的异质性;尤其是散发性ALS,相关基因突变也是数量庞大。iPSC最明显的优势就在于,理论上可以为每一位确定的ALS患者建立iPSC系,该干细胞系有着明确的疾病相关性和遗传信息。相比较ALS动物模型,ALS患者的iPSC系可以给ALS研究者提供更加丰富的病理模型。——微观的研究对象。前面提到过,在临床上ALS主要是通过间接方法进行诊断,而ALS的基础研究主要是基于动物模型。相比较,iPSC-运动神经元则可以在体外以细胞为单位进行研究,当分化为运动神经元后更容易实施细胞和分子水平上的观察、检测和实验,这对研究致病机理、分析微观表型、发现生物标记物和高通量地筛选小分子药物都具有非常重要的意义。——多样的分化细胞。iPSC的多能性不容忽视:目前已经可以将iPSC诱导分化为上运动神经元、下运动神经元、脊髓神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞亚型,这样一来就可以研究在ALS的致病机制中,不同神经细胞亚型各自发挥的作用机理,以及不同神经细胞亚型之间的动态和互作关系,甚至可以在体外更好地重现运动神经元的体内环境。iPSC对于ALS研究也不是没有缺点。前面提到过,ALS具有迟发性,而且发病可能还与特殊的生理和环境因素有关;这些和其他ALS病理模型一样,是iPSC-运动神经元无法还原的。另外一点就是,iPSC-运动神经元终究是体外系统,也无法囊括非细胞自主的病理表型,因此任何相关的发现均需与体内试验或ALS患者样本进行交互验证。三利用iPSC筛选治疗ALS药物的总述1、基本流程A、确定iPSC的患者来源。家族性或散发性ALS患者?何种基因型?制备近等基因系对照?B、确定iPSC的诱导方法和运动神经元的分化方法。是否通过细胞分选来提高细胞纯度?C、确定药物筛选的病理表型。细胞死亡或其他表型?能否通过图像采集进行定量分析?D、确定药物筛选的操作平台。一般基于96或384孔板。能否高通量、全自动地进行?E、确定小分子化合物文库。是否为临床上正在使用的、或正在进行临床试验的药物?F、确定数据分析方法。图像采集算法和数据分析方法一般是客制的。G、确定结果验证方法。是否使用更多的ALS基因型?是否筛查更多的病理表型?H、最后决定是否进入临床前或临床试验。2、药物安全性和药效药物的安全性是首要的,不可伤敌八百,自伤一千。小分子化合物对运动神经元的安全性体现在:无论对ALS-iPSC-运动神经元还是对对照-iPSC-运动神经元,都不会导致细胞死亡或导致病理表型的恶化。如果小分子化合物文库是临床上正在使用的、或正在进行临床试验的药物,那么筛选出来的候选药物的安全性通常是有一定保障的,进一步的开发过程通常可以省去很多相关试验——而这部分药物安全性的试验往往是新药开发中最昂贵的部分。至于药效,指药物能否改善ALS病理表型指标,以及改善的程度。四用iPSC筛选ALS治疗药物的开创性研究和腰果酸的发现2007年至2018年间,全球共进行了86项针对治疗ALS的临床试验,其中绝大多数有关小分子药物。这些试验或最终完成,或中途终止,但最终却只有一个药物获得了FDA的批准,即2017年5月获准应用于ALS治疗的依达拉奉。这些小分子在ALS动物模型中都展示了出色的效果,但是当用到ALS患者身上时却总是毫无效果。日本京都大学的山中伸弥和井上治久教授认为,ALS治疗药物开发的成功率极低是因为ALS动物模型并不是适合筛选ALS治疗药物的疾病模型;同ALS患者一样,ALS动物模型中的运动神经元也难以直接进行研究。于是,井上治久研究组先将ALS患者的皮肤成纤维细胞诱导成为iPSC,再将iPSC分化成为运动神经元。这些iPSC-运动神经元具有ALS的分子病理表型,包括较短的轴突和细胞质聚集体等,并且在氧化胁迫下可以更快地凋亡——至此,确定了来自ALS患者的iPSC-运动神经元作为研究ALS的体外细胞模型的可行性。最后,在筛选了4个小分子化合物后,发现腰果酸可以逆转运动神经元的ALS病理表型——至此,确定了来自ALS患者的iPSC-运动神经元作为ALS治疗药物筛选工具的可行性。诱导iPSC的皮肤成纤维细胞采样自带有TDP-43突变基因的家族性ALS患者。TDP-43是一个由414个氨基酸组成的核蛋白,含有的2个RNA识别模序可与细胞核内的mRNA结合。TDP-43参与了RNA代谢的多个步骤,包括mRNA的转录、剪切和运输等。采样患者的皮肤细胞来自3名不同的家族性ALS患者,分别带有Q343R、M337V和G298S等3个不同的TDP-43突变基因,并诱导出9个不同的iPSC系,用以避免因突变或克隆间的个体差异产生的错误。对照(iPSC-运动神经元)来自5个健康成人个体皮肤成纤维细胞诱导出的7个iPSC系。1、ALS患者及对照的皮肤成纤维细胞通过逆转录病毒或游离载体被成功诱导为iPSC,并表达了人类胚胎干细胞的生物标志物。接着,ALS患者及对照的iPSC被成功分化为运动神经元,并表达了运动神经元的生物标志物;当这些运动神经元与肌肉细胞共培养时,可产生正确的自发动作电位和突触电位。TDP-43基因突变并未影响iPSC向运动神经元的分化。2、和对照相比较的细胞和分子表型分析发现,ALS-iPSC-运动神经元:具有较短的轴突长度,这和在ALS斑马鱼模型中的发现一致;具有更低的神经纤维mRNA含量,这和在ALS患者尸检中的发现一致,而且编码细胞骨架中间体纤维的基因的表达量下降,也都与轴突较短的表型相吻合。3、和对照相比较发现,ALS-iPSC-运动神经元:细胞质中出现大量不溶于非离子表面活性剂的包涵体,包涵体内含TDP-43蛋白聚集体,这和在ALS患者尸检中的发现一致;TDP-43和RNA剪切因子SNRPB2的蛋白含量都有增加,并且在细胞核中共定位,这也和在ALS患者尸检中的发现一致;在亚砷酸盐诱导的氧化胁迫下,包涵体中TDP-43的含量增加,细胞存活率显著下降。基于上述2和3,说明ALS-iPSC-运动神经元可作为ALS病理的体外细胞模型。4、TDP-43蛋白可以结合到自身mRNA末端的顺式区域,通过负反馈机制调控自身的蛋白合成。和对照相比较发现,ALS-iPSC-运动神经元中TDP-43蛋白的mRNA含量上升。基因芯片分析结果显示,ALS-iPSC-运动神经元中有关RNA结合、加工、剪切和运输、mRNA加工和剪切、以及核糖体蛋白复合体和RNA剪切复合体的基因表达量的上升最为显著,说明基因转录和RNA剪切功能失调。5、根据上述基因芯片的检测结果,井上治久研究组测试了4种调控基因转录的小分子药物:曲古抑菌素A、spliceostatin A、山竹醇和腰果酸。治疗ALS药物的筛选平台是在用亚砷酸盐诱导氧化胁迫与否的条件下,检测ALS-iPSC-运动神经元和对照-iPSC-运动神经元细胞存活的情况:药物的安全性表现为,当药物处理运动神经元时不会导致细胞死亡;药物的有效性表现为,药物可以防止ALS-iPSC-运动神经元在氧化胁迫下凋亡。筛选结果显示,腰果酸安全且有效,spliceostatin A和山竹醇安全但无效,曲古抑菌素A不安全且无效。6,验证试验的结果显示,在ALS-iPSC-运动神经元中腰果酸可以将TDP-43的mRNA表达量降低147倍,降低包涵体中TDP-43蛋白的含量,并增加轴突的长度;这些结果说明腰果酸可以有效逆转ALS-iPSC-运动神经元的病理表型,是治疗ALS的候选药物,同时也说明ALS-iPSC-运动神经元及相关平台可被用于筛选治疗ALS的小分子药物。该项研究成果于2012年发表在《科学》杂志子刊《科学-转化医学》上,是用iPSC筛选ALS治疗药物的开创性研究。至于腰果酸是否可在临床上用于ALS治疗,原创研究中仅仅筛选了4个候选药物显然是没有什么诚意的,试验结果显示腰果酸也不是非常安全;特别是作为组蛋白乙酰转移酶抑制剂,腰果酸可能涉及的分子生化途径非常广泛,并非是特异的ALS靶向药。因此,该项研究在ALS治疗药物的筛选方面,更倾向于概念验证的性质,而实际上后来腰果酸也没有进入临床试验。五对ALS-iPSC-运动神经元的神经电生理检测和瑞替加滨的发现对ALS致病机理的研究存在着2种假说。第一种是神经兴奋毒性假说,认为过量的谷氨酸突触活性导致了钙离子过载和运动神经元凋亡。第二种是神经超兴奋性假说,认为神经轴突细胞膜的超兴奋性导致了ALS——对运动神经元的电导性研究发现,ALS患者的轴突细胞膜的兴奋性增加,但是远离突触区域,且这种超兴奋性的程度与ALS患者的生存期负相关;轴突细胞膜超兴奋性的产生可能与持续性钠电流的上升或延迟整流钾电流的下降有关。在ALS动物模型(SOD1G93A基因突变)中也发现了运动神经元的超兴奋性。美国哈佛大学医学院的伊根和沃尔夫教授支持神经超兴奋性假说。他们的研究组先将家族性ALS患者的皮肤成纤维细胞诱导成为iPSC,再将iPSC分化成为运动神经元。多电极芯片和膜片钳等神经电生理检测技术记录下了ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性,再现了ALS患者的神经生理学临床表型。这种超兴奋性的产生可能与延迟整流钾电流水平的下降有关;小分子药物瑞替加滨是一种电压门控钾离子通道的激活剂,试验发现它可以抑制这种超兴奋性,并在体外延长ALS-iPSC-运动神经元的存活。该项研究的结果表明,对iPSC-运动神经元的神经电生理检测可被用来验证疾病的临床表型、研究ALS的致病机理以及发现ALS的治疗药物。这项研究主要分为2大部分。第一部分主要是对ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性在神经电生理、细胞和分子等水平上的表型鉴定。1、ALS-iPSC-运动神经元来源自2名无亲缘关系、但都携带相同的SOD1A4V基因突变的家族性ALS患者。对照-iPSC-运动神经元来源自2个健康成人。2、在携带SOD1A4V基因突变的ALS患者与作为对照的健康成人之间,除了SOD1基因存在差异外,在两者的基因组上还存在着非常广泛的单核苷酸多态性;而这些遗传背景上的差异可能对两者运动神经元间表型上的差异造成影响,从而使研究结论产生偏差。为消除这种可能存在的偏差,研究者基于SOD1A4V/+基因型制备了正常(野生型)SOD1+/+基因的近等基因系iPSC;也就是说,突变体和野生型的近等基因系iPSC之间,除了在SOD1基因上的差异外,其他遗传背景几乎完全相同。和一般的健康成人的iPSC-运动神经元相比较,这个野生型SOD1基因近等基因系的iPSC-运动神经元是一个更为严谨的对照。3、为了检测ALS-iPSC-运动神经元以自发放电为表现的兴奋性,研究者使用了2种神经电生理检测技术。第一种技术是细胞外多电极芯片:在每个培养孔中都有64个呈网格状排列的电极,记录着培养孔中每个运动神经元的动作电位。多电极芯片检测结果显示,和对照(包括野生型SOD1基因的近等基因系)相比较,ALS-iPSC-运动神经元产生的自发动作电位显著增加,说明其具有超兴奋性。第二种技术是全细胞膜片钳技术。在响应慢速渐进式去极化的过程中,ALS-iPSC-运动神经元触发的动作电位数量显著高于对照(包括野生型SOD1基因的近等基因系)-iPSC-运动神经元,说明其具有超兴奋性。4、研究者用绿色荧光蛋白GFP标记运动神经元进行多电极芯片检测,用红色荧光蛋白RFP标记运动神经元进行膜片钳检测,以保证实验用细胞类型的准确性。5、用膜片钳技术还可以定量检测出决定神经元兴奋性的特异性电流。电压钳实验结果显示,和对照(包括野生型SOD1基因的近等基因系)相比较,ALS-iPSC-运动神经元的延迟整流钾离子通道减少,进而降低了延迟整流钾流,从而使触发的动作电位增加、导致超兴奋性。第二部分主要是发现瑞替加滨可以作为治疗ALS的候选药物。1、在多种电压门控钾离子通道中,Kv7通道最适合补偿延迟整流钾流、抑制运动神经元的超兴奋性。小分子药物瑞替加滨是Kv7通道阈下钾流的特异性激活剂,也是临床上批准使用的抗痉挛药。全细胞膜片钳实验的结果显示,瑞替加滨可以阻止ALS-iPSC-运动神经元的自发放电。多电极芯片记录的结果显示,瑞替加滨可以在抗癫痫的药理学浓度上阻止ALS-iPSC-运动神经元的自发放电。以上结果说明,瑞替加滨能够抑制ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性。2、当在体外培养时,ALS-iPSC-运动神经元在成熟15天后开始凋亡,且死亡率始终高于对照-iPSC-运动神经元。用瑞替加滨处理14天后,ALS-iPSC-运动神经元的死亡率下降25%,说明瑞替加滨能够延长ALS-iPSC-运动神经元的存活时间,其作用机理与缓解线粒体胁迫有关。3、上述试验结果都是基于携带SOD1A4V基因突变的家族性ALS患者来源的iPSC-运动神经元。为了验证ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性和瑞替加滨的疗效具有普遍性,研究者又针对携带3种不同SOD1基因突变的4名不相关患者的4个iPSC系、携带C9orf72基因突变的2名不相关患者的2个iPSC系和携带2种不同FUS基因突变的2名不相关患者的2个iPSC系进行了研究。多电极芯片记录结果显示,分化自这些iPSC系的运动神经元都具有超兴奋性,并且它们的自发动作电位都可以被瑞替加滨所阻遏。以上结果说明,家族性ALS患者的iPSC-运动神经元在体外具有的超兴奋性以及对瑞替加滨的敏感性都具有普遍性。该项研究成果于2014年发表在《细胞》杂志子刊《细胞-报告》上,首次对ALS-iPSC-运动神经元进行了神经电生理表型鉴定。值得注意的是,ALS的迟发性意味着患者在出生后的数十年后方才起病,然而ALS-iPSC-运动神经元在成熟后的数周后即可再现临床上的病理表型,这可能与ALS-iPSC-运动神经元在体外缺乏神经胶质细胞的支持及抑制性回路等体内环境有关,这也是ALS-iPSC-运动神经元作为病理模型的一个固有的缺陷。至于瑞替加滨是否可在临床上用于ALS治疗,我本人并不看好。首先,ALS运动神经元的超兴奋性仅仅是导致运动神经元凋亡的可能因素之一,而它和细胞凋亡之间的关系也尚不清楚。其次,导致ALS运动神经元超兴奋性的主要原因是持续性钠流,这也是ALS延缓药物利鲁唑所靶向的调控位点;电压门控钾离子通道的贡献位居其次,因此无法期待仅对它的调控就可以非常有效地抑制运动神经元的超兴奋性。最终,运动神经元的超兴奋性可能只是ALS致病机理中偏下游的病理表型,而非最上游、最主要的触发机制,因此对它的调控也许只能起到有限的、延缓病情发展的作用。当然,瑞替加滨作为抗癫痫药已经在临床上使用了多年,其应用在其他神经退行性病变上的安全性是有所保障的。瑞替加滨有关ALS的二期临床试验由葛兰素史克公司和哈佛大学医学院联合开展,已于2015年6月开始,并于2018年2月结束。该项临床试验虽然是以ALS患者为试验对象,但是试验的目的并非是检测和评估瑞替加滨治疗ALS的效果,而是研究瑞替加滨对ALS患者运动神经元兴奋性的作用。该项临床试验采取的主要检测方法是用经颅磁刺激技术检测上运动神经元的兴奋性,以及用神经轴突传导阈值示踪技术检测下运动神经元的兴奋性;并无ALS病情检测的常规内容(例如ALS病情指数、肌力和肺功能等指标),而是仅仅记录应试患者自述的肌肉痉挛情况。相关临床试验结果尚未发表。六用ALS-iPSC-运动神经元进行高通量小分子药物筛选和博舒替尼的发现时隔5年后,日本京都大学的井上治久研究组再度出击,以携带SOD1基因突变的家族性ALS患者为出发点,诱导出iPSC系并进一步分化出运动神经元,并以ALS-iPSC-运动神经元的存活率为衡量标准,对现有的临床药物进行了高通量的筛选。在筛选的1416种药物中,有27种可以在体外提高ALS-iPSC-运动神经元的存活率,其中又有过半的药物靶向Src/c-Abl信号途径。敲低Src/c-Abl的表达,和使用Src/c-Abl抑制剂一样,可以延缓ALS运动神经元的凋亡。其中,Src/c-Abl抑制剂博舒替尼可以在ALS运动神经元中增强自体吞噬,减少突变的SOD1蛋白的错误折叠,对来源于多种基因型的家族性和散发性ALS患者的iPSC-运动神经元可在体外提高其存活率,并可在体内延长ALS小鼠的存活期,因此是治疗ALS的候选药物。Src和c-Abl是在人体内广泛存在的、非受体性的酪氨酸激酶,其编码基因与病毒编码的致癌基因同源。Src的激活与细胞增殖、凋亡、侵染和血管生成相关,并参与肿瘤形成,因此成为了肿瘤治疗的靶标。c-Abl的融合蛋白具有致癌性,可导致慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病,因此c-Abl的抑制剂已被开发成为治疗慢性髓性白血病的药物。Src/c-Abl还参与了多种神经退行性病变的致病过程,该项研究发现它们也参与了ALS的致病过程。这项研究主要分为2大部分。第一部分主要是用ALS-iPSC-运动神经元建立ALS治疗药物的高通量筛选平台,并用该平台发现了博舒替尼。1、作为对照的健康成人和携带SOD1L144FVX基因突变的家族性ALS患者的皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞被诱导成iPSC系;ALS-iPSC系经CRISPR-Cas9基因编辑后,被校正为含有(正常的)野生型SOD1基因的近等基因系iPSC,并和来自健康成人的iPSC系一起作为对照。2、上述iPSC系被分化成运动神经元,并成功表达了运动神经元的生物标志物;这些iPSC-运动神经元可与人类成肌细胞形成神经肌肉接点,并具有神经电生理活性。ALS-iPSC-运动神经元中含有突变的SOD1蛋白经错误折叠后形成的聚集体;和对照相比较,ALS-iPSC-运动神经元具有较低的细胞存活率,而其存活率的变化后面被用作筛选ALS治疗药物的主要指标。3、高通量药物筛选的方案:将单细胞的iPSC放置在96孔板的培养孔中诱导分化,7天后可发育成运动神经元;此时在每个培养孔中相应加入候选的小分子药物后继续培养,在第二个7天后进行固定和微管蛋白免疫染色;之后利用IN 6000型细胞分析仪对存活的运动神经元进行自动化、高通量的图像捕捉和统计分析。已知可提高ALS-iPSC-运动神经元存活率的肯帕罗酮被用作候选小分子药物的正对照,载体溶剂DMSO被用作负对照。尽管ALS患者的病情具有高度的异质性,ALS的细胞和分子表型以及致病机理的假说也多种多样,但是运动神经元的凋亡是所有ALS病例共同的病理特征。因此,使用ALS-iPSC-运动神经元的存活率作为药物筛选的评价指标是最为稳妥的思路。4、待筛选的小分子药物文库包含有1416种化合物,均为目前临床上正在使用的、或正在进行临床试验的药物。经筛选,其中有27个化合物可以显著提高ALS-iPSC-运动神经元的存活率,而其中的14个化合物均靶向Src/c-Abl信号途径。最终,研究者聚焦在了博舒替尼,并着手进行下一步的深入研究,因为博舒替尼可以直接抑制Src/c-Abl,作用浓度低,具有剂量依赖性(效果随剂量的增加而逐渐提高),且没有细胞毒性。第二部分主要是验证博舒替尼的作用,及用其治疗ALS的分子机理。1、通过RNA干扰技术敲低ALS-iPSC-运动神经元中Src或c-Abl的表达后,ALS-iPSC-运动神经元的存活率上升,暗示着博舒替尼对Src/c-Abl的抑制可以延缓ALS运动神经元的凋亡。2、ALS-iPSC-运动神经元在体外的细胞和分子病理表型、以及博舒替尼的相关作用如下:A、西部印记实验和酶联免疫吸附测定结果显示,Src/c-Abl的磷酸化水平升高,博舒替尼可降低其磷酸化水平;B、蛋白标志物检测结果显示,细胞的自体吞噬紊乱,博舒替尼可将其恢复到近正常水平;博舒替尼对ALS-iPSC-运动神经元的保护作用可被自体吞噬抑制剂所阻断,说明博舒替尼的保护作用可能与增加自体吞噬过程有关;C、西部印记实验结果显示,突变SOD1蛋白的错误折叠增加,博舒替尼可降低错误折叠;D、细胞内ATP含量降低,博舒替尼可提高细胞内ATP含量;与卡尔文循环和呼吸电子传递链相关的基因的表达量上升,博舒替尼可降低其表达量,说明它可以恢复细胞的能量平衡。以上结果说明,ALS-iPSC-运动神经元在体外具有ALS的病理表型,并可被博舒替尼逆转。3、上述试验结果都是基于携带SOD1L144FVX基因突变的家族性ALS患者来源的iPSC-运动神经元。研究者又测试了2种不同SOD1基因突变、3种不同TDP-43基因突变、3种不同C9orf72基因突变和3名散发性ALS患者的iPSC系。测试结果显示,博舒替尼可以延长所有这些iPSC-运动神经元的体外存活时间,并且减少它们因蛋白错误折叠而产生的聚集体。以上结果说明,博舒替尼延长运动神经元体外存活时间的作用对家族性和散发性ALS患者具有普遍性。4、上述试验结果都来自博舒替尼对ALS-iPSC-运动神经元的体外实验。Src/c-Abl抑制剂的体内试验结果显示,当博舒替尼通过腹腔内注射进入ALS小鼠体内后,轻微延缓了小鼠的ALS发病时间约10.8天,并延长了小鼠的存活期约7.8天。博舒替尼在ALS小鼠体内降低了Src/c-Abl的活性、减少了脊髓内突变的SOD1蛋白的错误折叠、并增加了运动神经元的存活数量。以上结果说明,在体内博舒替尼对Src/c-Abl的抑制延缓了ALS运动神经元的退行性病变。该项研究成果于2017年发表在《科学》杂志子刊《科学-转化医学》上,是利用ALS-iPSC-运动神经元对ALS治疗药物进行高通量筛选的经典案例。2019年3月28日,日本放送协会(NHK)报道了日本京都大学井上治久研究组宣布开始进行博舒替尼治疗ALS的临床试验。该临床试验将在京都大学附属医院等4家医疗机构开展,募集最多24名应试患者;这些应试患者将首先连续12周服用该药,以确认药物的安全性。到目前(2019年4月21日)为止,该项临床试验尚未在美国FDA登记。用治疗慢性髓性白血病的临床药物博舒替尼治疗ALS至少有2个优势:首先,既然博舒替尼已经在临床上获得应用,说明其用药安全性是有保障的;另外,博舒替尼是用提高ALS运动神经元的体外存活率作为指标筛选出来的,该指标直指ALS最基础、最核心的病理表型——运动神经元的凋亡;由此可见,博舒替尼治疗ALS的作用机理能够切中要害,而不像瑞替加滨,首先针对的是降低运动神经元的超兴奋性。至于博舒替尼最终是否可在临床上用于治疗ALS,还要看其临床试验的疗效结果。在最初筛选出的Src/c-Abl抑制剂中,博舒替尼在体外的效果并非最好,但是它具有剂量依赖性,并且可以直接抑制Src/c-Abl,因此最终被研究者选出。博舒替尼在ALS小鼠模型(SOD1G93A)中的体内实验也是战绩平平,也因此研究者在论文中认为临床转化博舒替尼时机尚不成熟,但这和它对ALS-iPSC-运动神经元(SOD1G93A)的体外实验的结果一致。博舒替尼能够缓解线粒体逆境胁迫的病理表型也不具有普遍性:在家族性ALS患者中,该表型只存在于携带SOD1和C9orf72基因突变的患者中,而不存在于携带TDB-43和FUS基因突变的患者中。然而,博舒替尼对来源自C9orf72基因突变的家族性ALS患者和散发性ALS患者的iPSC-运动神经元的体外实验战绩不俗,说明博舒替尼在治疗ALS时潜在的应用范围可能还比较广泛。七利用iPSC筛选ALS治疗药物的其他研究以上详细介绍了3项有关利用iPSC筛选ALS治疗药物的研究,第一项是该领域的开创性工作,另外两项也都筛选出了进入临床试验的药物。利用iPSC筛选ALS治疗药物还有其他很多项研究,下面按时间顺序简要介绍一下这些研究的成果。1、2013年,《细胞-干细胞》,美国哈佛大学筛选用的运动神经元来自健康小鼠和ALS小鼠(过表达人类SOD1G93A突变基因)的胚胎干细胞系——没错!这里没有使用人类ALS患者的iPSC系。通过在细胞培养中戒断营养因子的供应来诱导运动神经元凋亡,再加入候选药物,观察其能否延长运动神经元的生存。筛选过程在384孔板上以高通量、全自动的方式进行;以具有抗细胞凋亡作用的蛋白合成抑制剂放线菌酮为正对照,共筛选了约5000个化合物和生物活性物质,结果发现神经保护因子、具有抗细胞凋亡作用的蛋白或DNA合成抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制剂、大麻素受体激活剂、靶向钙离子通道的神经递质受体配基和包括肯帕罗酮在内的激酶抑制剂等可延长运动神经元的生存。肯帕罗酮还能够减少突变的SOD1蛋白的聚集,但不改变运动神经元轴突和突触的形态和神经电生理功能。尽管在筛选过程中使用的是小鼠胚胎干细胞来源的运动神经元,但是在验证过程中使用了携带SOD1和TDP-43基因突变的家族性ALS患者来源的iPSC-运动神经元,并且发现肯帕罗酮可以延长后者的生存。2、2013年,《分子和细胞神经科学》,美国iPierian公司ALS-iPSC-运动神经元来自8名家族性和16名散发性ALS患者,并被精细分化为上-和下-运动神经元;当与星形胶质细胞共培养时,可较快产生神经电生理特性。早期研究结果显示,在全部散发性ALS患者和非SOD1基因突变的家族性ALS患者的运动神经元内都发现了TDP-43聚集体,说明该病理表型具普遍性,并出现在其他神经退行性病变中。在本项研究中,研究者在3名散发性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元中也发现了TDP-43聚集体:这些聚集体位于细胞核内,被高度磷酸化但未被泛素化;这些病理表型与其中1名患者的尸检结果一致。由此,研究者以TDP-43核内聚集体为筛选指标,观察候选药物能否抑制TDP-43聚集体的产生。筛选过程在384孔板上以高通量、全自动的方式进行,共筛选了1757个化合物,结果发现4大类的38个化合物可减少TDP-43核内聚集体:CDK激酶抑制剂(肯帕罗酮同类)、JNK激酶抑制剂、雷公藤甲素和FDA批准临床使用的强心苷(地高辛、毛花苷C和原海葱苷A)。强心苷是钠/钾泵抑制剂,能够改变钙离子流、提高细胞内ATP含量,而且具有神经保护作用、能够抑制SOD1聚集体的产生、以及防止多聚谷氨酸诱导的细胞死亡。3、2013年,《科学-转化医学》,美国Cedars-Sinai医学中心六核苷酸GGGGCC重复在C9orf72基因的非编码区(启动子或内含子等)的扩增导致了45%的家族性ALS和10%的散发性ALS的发生,并与阿尔茨海默病和帕金森症等其他神经退行性病变的发生相关。然而,该重复的扩增是C9orf72基因的功能缺失性突变还是功能获得性突变尚无定论。对来自4名携带C9orf72基因突变的家族性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元进行研究发现,该基因的表达量并未下降,敲低其表达量后对细胞也无毒害作用;然而六核苷酸重复的转录却上升了,并形成可能改变RNA代谢的RNA聚集体,同时。靶向C9orf72基因的反义RNA可以抑制RNA聚集体的形成,并逆转基因表达谱的改变,进一步证明了六核苷酸GGGGCC重复的扩增是该基因的功能获得性突变。反义RNA目前主要作为一种负向遗传学手段应用于对基因的功能研究,研究者也未调查该反义RNA对ALS运动神经元病理表型的作用。不同于小分子药物,反义RNA用于人类疾病治疗的技术尚不成熟。因此对于ALS而言,该反义RNA对基础研究的意义远大于临床治疗。4、2013年,《神经元》,美国约翰霍普金斯大学对来自4名携带C9orf72基因突变的家族性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元进行研究发现:六核苷酸GGGGCC重复在细胞核内形成RNA聚集体;运动神经元的基因表达谱发生改变;能够与六核苷酸GGGGCC重复相互作用的RNA结合蛋白ADARB2数量减少;ALS-iPSC-运动神经元对谷氨酸介导的神经兴奋毒性的敏感度上升100倍。这些病理表型与ALS患者的尸检结果一致。接着,研究者构建了250多种与C9orf72基因不同区段的序列互补的反义RNA,且从中筛选出不减少C9orf72基因的表达量、但可以与六核苷酸重复序列相结合并解除其与RNA结合蛋白相互作用的反义RNA。这些反义RNA可以在体外逆转ALS-iPSC-运动神经元的上述病理表型,包括可以提高其受到谷氨酸胁迫时的存活率。该项研究同样证明了六核苷酸GGGGCC重复的扩增是C9orf72基因的功能获得性突变,即获得了RNA毒性。尽管这些反义RNA在体外可以延长ALS运动神经元的生存,但是鉴于反义RNA用于人类疾病(尤其是中枢神经系统的疾病)治疗的技术尚不成熟,因此对于ALS而言,这些反义RNA对基础研究的意义远大于临床治疗。5、2015年,《自然》,美国约翰霍普金斯大学在果蝇中,仅仅六核苷酸GGGGCC重复本身就能引发运动神经元的退行性病变;细胞核质运输的调节因子RanGAP是其抑制子,可以抑制六核苷酸重复的神经毒性,而增强入核运输也可起到同样的作用。在携带C9orf72基因突变的家族性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元中,六核苷酸重复可以与人类的RanGAP同源蛋白相结合并破坏后者的功能,使核蛋白无法从细胞质向细胞核内运输,而靶向六核苷酸重复的反义RNA则可以恢复正常的入核运输。在果蝇中,卟啉化合物TMPyP4可以解除六核苷酸重复和RanGAP之间的结合,从而恢复正常的入核运输;核输出蛋白1抑制剂KPT-276在抑制出核运输的同时,也可补偿入核运输的缺陷。TMPyP4和KPT-276都可以抑制六核苷酸重复引发的运动神经元退行性病变。TMPyP4和KPT-276并未在ALS-iPSC-运动神经元中进行测试,而反义RNA也未在ALS-iPSC-运动神经元中测试其对存活率的影响。这3者在该项研究中的作用,还主要是针对理论验证,证明六核苷酸GGGGCC重复通过对细胞核质运输的抑制来引发运动神经元退行性病变。6、2015年,《自然-通信》,美国威斯康辛大学针对当前将人类多能干细胞分化成运动神经元时效率低和纯度差等问题,张素春研究组改进了方法,通过化学小分子调控多条信号途径,最终在28天内可将人类胚胎干细胞分化成为大量的、高纯度(>90%)的、功能完好的成熟运动神经元;该方法也适用于人类iPSC。在ALS中受损伤的脊髓运动神经元位于脊髓前角,并将轴突伸向肌肉细胞以指挥其运动,轴突变短是ALS的病理表型。研究者用荧光素酶标记轴突,以轴突长度的变化作为表型指标就可以高通量、全自动地筛选ALS治疗药物。利用新的运动神经元分化方法,先导性验证试验发现肯帕罗酮和EphA抑制剂可以促进ALS-iPSC-运动神经元轴突的生长,但是利鲁唑则不行。携带SOD1D90A基因突变的星形胶质细胞能够抑制ALS-iPSC-运动神经元轴突的生长,经基因校正后的野生型SOD1近等基因系来源的星形胶质细胞则不会。试验结果显示,肯帕罗酮、EphA抑制剂和利鲁唑都不能解除SOD1D90A星形胶质细胞对ALS-iPSC-运动神经元轴突生长的抑制。该项研究除了建立用人类iPSC分化出运动神经元的新方法外,还验证了以运动神经元轴突长度为表型指标建立高通量、全自动的筛选平台用以发现ALS治疗药物的可行性7、2017年,《自然-通信》,比利时VIB脑科学和疾病研究中心ALS通常由患者肢体的远端起病;由于控制肢体远端肌肉的运动神经元具有更长的轴突,因此有假说认为轴突运输缺陷导致了ALS。携带FUS基因突变的家族性ALS患者的皮肤成纤维细胞被诱导成iPSC;ALS-iPSC经CRISPR-Cas9基因编辑后被校正为含有野生型FUS基因的近等基因系iPSC,并和来自健康成人的iPSC一起作为对照。ALS-iPSC-运动神经元在体外具有典型的FUS蛋白亚细胞定位错误、低兴奋性和轴突运输缺陷。移动性的线粒体或内质网囊泡经染色标记后进行成像和分析,用以定量测定其沿轴突运输的数量:在ALS-iPSC-运动神经元中的数量显著降低,说明轴突运输存在缺陷。组蛋白去乙酰酶HDAC6具有微管蛋白去乙酰活性,Tubastatin A和ACY-738可特异性地抑制该活性。在ALS-iPSC-运动神经元中,2个HDAC6抑制剂可以减少微管蛋白的乙酰化,并恢复正常的轴突运输。尽管Tubastatin A和ACY-738可以通过抑制HDAC6来逆转ALS运动神经元轴突运输缺陷的病理表型,但是2个抑制剂至今并未进入临床试验。8、2018年,日本庆应义塾大学,盐酸罗匹尼罗2018年12月3日,日本共同社报道了日本庆应义塾大学冈野荣之研究组宣布开始进行盐酸罗匹尼罗治疗ALS的I/IIa期临床试验,用以评估其安全性和疗效。该研究组利用iPSC技术筛选了1232种目前临床上正在使用的药物,并从中发现目前用于治疗帕金森症的药物盐酸罗匹尼罗能够在体外改善ALS-iPSC-运动神经元的病理表型,包括神经轴突缩短、线粒体功能障碍、蛋白质异常聚集、氧化应激加剧和细胞凋亡增加等。在该项研究中,iPSC来源自ALS患者的外周血细胞;在筛选获得治疗ALS的候选药物中,盐酸罗匹尼罗可通过血脑屏障并具有较小的副作用,而且不仅对(除SOD1基因突变外的)家族性ALS患者、对大约70%的散发性ALS患者也可能有效。相比较利鲁唑和依达拉奉,预计盐酸罗匹尼罗有其2~3倍的疗效,即延长ALS患者的存活期可达半年。将有20名应试ALS患者(20~80岁,发病不超过5年,ALS病情指数在24分以上,肺功能在70%以上,住所距离医院较近,可疑、可能或确定的轻度ALS患者:基本可以做家务和工作、或能独立进行日常生活)参加该项临床试验,并将服用盐酸罗匹尼罗片剂半年。继京都大学和庆应义塾大学分别针对骨骼疑难病症和听力障碍后,这是日本国内第三例利用iPSC技术筛选出的药物进行的临床试验,也是全球首例针对ALS的iPSC发现新药的临床试验。盐酸罗匹尼罗是英国葛兰素史克公司根据多巴胺结构研发的多巴胺受体激动剂,并作为治疗帕金森症的药物于1996年通过审批。不仅是II型多巴胺受体激动剂,盐酸罗匹尼罗还在动物模型中显示出抗氧化作用、促进产生神经营养因子及促进神经干细胞繁殖等神经保护作用,因此可望延缓ALS患者病情的发展,但不会使ALS停止发展、病情逆转或被治愈。早先的研究结果显示,可转化为多巴胺的多巴丝肼对ALS无效。冈野荣之研究组并未发表其ALS-iPSC-运动神经元的筛选平台,也未发表盐酸罗匹尼罗治疗ALS的验证试验。以上信息主要来自新闻报道。该项临床试验也未在美国FDA登记。因此,本文未能就此项研究做详细介绍。八利用iPSC筛选治疗ALS药物的总结早期的ALS治疗药物的筛选和临床前试验,都是以过表达人类SOD1突变基因的小鼠或大鼠为病理模型展开的。尽管携带SOD1基因突变的家族性ALS患者仅占ALS患者总数的1~2%,也就是说其发病率只有千万分之1~2,但是由于该致病突变发现较早,又有动物模型,因此在相当长的时间里被广泛应用在ALS的基础研究和药物筛选中。和ALS动物模型相比较,ALS-iPSC-运动神经元具有以下优势:A、人类细胞;B、来自真实的ALS患者,包括那些在遗传学上尚未发现致病基因的散发性ALS患者;C、可以将ALS的病灶——运动神经元从复杂的生理结构中剥离出来,单独进行研究;D、在细胞和分子水平上可重现生理和解剖水平上的病理表型,并以此进行表型筛选;E、体积小、纯度高、同步性好、重复性好、可以大量扩增,适合高通量的药物筛选。不难想象,以ALS-iPSC-运动神经元为筛选平台及验证模型,将成为今后ALS治疗药物发现和临床前试验的“标配”,也将在ALS的基础研究和生物标志物发现中发挥重要作用。最后总结一下,利用iPSC筛选治疗ALS药物的重点在以下4方面:1、ALS-iPSC-运动神经元的来源家族性ALS患者的来源具有以下3个优势:A、致病的基因突变明确;B、细胞和分子表型清晰;C、相关的研究结果丰富。因此,目前仍是用于ALS治疗药物筛选的首选。家族性ALS患者的来源在具体使用上具有以下2方面的趋势:A、同时使用多种家族性ALS的遗传背景,包括SOD1、C9orf72、TDP-43和FUS等基因突变,同时使用同一基因突变的多个患者来源,以及同时使用一个患者来源的多个iPSC系;B、通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,将ALS-iPSC中的突变型基因校正为野生型基因,制备近等基因系iPSC,并和来自健康成人的iPSC一起作为对照。散发性ALS占90~95%的患病比例,也是用iPSC技术筛选ALS治疗药物最大的优势之一。至少在药效验证阶段,应该使用多个散发性ALS患者的来源,以确保候选药物的广谱性。2、ALS-iPSC-运动神经元用于药物筛选的病理表型A、运动神经元死亡是最具有普遍性和代表性的病理表型,其鉴定方法也相对简单。当然,运动神经元死亡也分为发育中的自然凋亡、去掉营养因子后诱发的死亡、以及添加胁迫因子后诱发的死亡等不同的方式。考虑到ALS实际发病具有迟发性(患者在出生后的数十年后方才起病),以及运动神经元实际上在体内处于被神经胶质细胞支持等更加复杂的生理环境中,因此运动神经元在体外短期内的死亡过程也未必能如实还原在体内对应的病理表型,而找到更接近运动神经元在体内衰老过程的体外诱导方法也是目前该领域亟待解决的一个问题。B、比较具有普遍性的病理表型还包括TDP-43聚集体的产生和运动神经元兴奋性的变化等。而细胞骨架结构异常、细胞核质运输缺陷、线粒体功能异常、内质网胁迫、RNA代谢异常和聚集体的产生、轴突长度变短和轴突运输缺陷等病理表型可能只与个别ALS遗传背景相关,因此上述研究中但凡使用了这些病理表型进行的药物筛选,选出的小分子化合物可能对ALS患者并不具有普遍的适用性。C、ALS-iPSC-运动神经元用于药物筛选的病理表型,无疑是决定筛选成功与否的最重要的因素。其间,各种病理表型在筛选成本上也存在较大的差异;使用多种表型指标可以提高筛选的准确性,但也会显著地增加筛选的成本。在筛选阶段使用细胞存活率外加一个普遍性、特异性的病理表型指标,在验证阶段则综合使用多个病理表型进行筛查,可以在控制成本的前提下提高ALS治疗药物筛选的成功率。3、ALS-iPSC-运动神经元用于药物筛选的试验平台A、常用的96孔板或384孔板系统,不仅可用于运动神经元的培养,而且可与一般的小分子化合物文库对接,还适合高通量、全自动的移液和图像采集。B、利用共聚焦显微镜进行荧光成像是最通用、也是最简单的成像方式,因此对ALS-iPSC-运动神经元病理表型的指标鉴定和定量测量应尽量使用这个技术。图像信号通常来自自发荧光(例如GFP或RFP)、荧光染色(例如荧光免疫杂交)或荧光显色(例如荧光素酶反应)。相反,对运动神经元进行高通量的神经电生理测定就需要相对复杂的仪器设备(例如多电极芯片),尽管神经电生理测定是对成熟运动神经元的功能最准确、最标准的检测和评估方法。C、iPSC除了具有人类真实的ALS遗传背景外,另一个不容遗弃的优势就是多能性。iPSC不仅可以分化成运动神经元,还可以分化成具有相同基因型的神经胶质细胞;将两者共培养,可以在体外为运动神经元提供一个更接近体内真实生理环境的发育条件,而在该条件下对运动神经元进行的药物筛选也将获得更加准确的结果。4、药物筛选使用的小分子化合物文库由于本文综述的几项研究或者主要着眼于基础理论的发现,或者对ALS治疗药物的筛选平台进行概念验证,因此这几项研究或者仅用了少数几个特异性的抑制剂,或者仅筛选了体量较小的化合物文库。如果筛选的化合物文库是目前临床上正在使用的药物,那么从中发现的候选的ALS治疗药物的作用机理已经比较明确,也利于在细胞和分子表型上进行实验验证;同时,其用药安全性也是有保障的,加之可以走孤儿药登记的绿色通道,一旦有效其市场化的进程将会是非常快捷的。对于筛选超大体量的小分子化合物文库,则应等待ALS致病机理取得突破性进展后再行展开——对引发疾病的最上游、最主要的代谢或信号途径进行大规模的抑制剂筛选才最有效。鉴于ALS是非常罕见的疾病,其治疗药物的市场容量很小,届时希望能有富有社会责任感、富有人文关怀精神的大型制药企业站出来承担这项成本高昂的筛选工作。结束语2016年,全球ALS药物的市场体量约为5300万美元;预计到2021年,全球ALS药物及疗法的市值将增至4.68~8.40亿美元之间,并将节省出更多的健康护理费用——仅在美国,2017年的ALS的患者看护费用就高达60亿美元。可见,新的ALS治疗药物市场前景广阔,又有孤儿药资格的绿色通道助力,更是ALS患者期待已久的福音。早先ALS治疗药物的筛选是建立在ALS动物模型的试验基础上,而当用于ALS患者身上时,或是因为意想不到的毒副作用,或是因为疗效不佳,致使在过去10年里进行的80多项临床试验几乎全军覆没。利用iPSC筛选治疗ALS药物是革命性的技术,必将改写该领域的格局,并加速更安全、更高效的ALS治疗药物的发现。ALS-iPSC-运动神经元还可以帮助研究者更快地解密ALS的核心致病机理,而只有靶向ALS致病的最上游、最主要的代谢或信号途径开发治疗药物,才是最根本、最有效的。可是谁又知道呢?不管黑猫白猫,能抓到耗子就是好猫。不过对于已经患病的ALS患者,想要减缓病情的发展或者停止病情的发展,可以靠小分子药物;但是想要逆转病情的发展或者根本上治愈,最终还要依靠干细胞治疗技术——而后者,也将是iPSC可以大显身手的战场。再次感谢Christian给我们带来的干细胞治疗ALS的信息,希望常在。